公开(公告)号：CN109280651B

公开(公告)日：2021-11-26

申请号：CN201811069893.X

申请日：2018-09-13

申请人： 四川自豪时代药业有限公司

发明人： 魏琪 ,  邱鹏 ,  蒋飞 ,  张骞 ,  王洪 ,  罗红

IPC分类号： C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。该发明依赖于遗传资源Lactobacillus bulgaricus的乳酸脱氢酶基因，在此基础上进行点突变并对基因序列进行密码子优化后，连接到表达载体上，构建重组质粒并导入大肠杆菌中，重组乳酸脱氢酶突变体在大肠杆菌中获得了可溶性高表达，离心收集的菌体经高压均质机破菌后，粗酶液可在低温下存放5天，活性无明显衰减。通过本方法制备的重组乳酸脱氢酶突变体与未进行突变及序列优化的重组乳酸脱氢酶相比，表达量提高了五倍以上，且在高pH值下的活性损失更小，有更广的pH值适用范围。本发明在乳酸发酵制备及NAD/NADH循环中有广阔的应用前景。

公开(公告)号：CN109280652A

公开(公告)日：2019-01-29

申请号：CN201811071121.X

申请日：2018-09-13

申请人： 四川自豪时代药业有限公司

发明人： 魏琪 ,  张骞 ,  邱鹏 ,  蒋飞 ,  王洪 ,  罗红

IPC分类号： C12N9/04 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法，步骤如下：(1)取含有乳酸脱氢酶突变体核苷酸序列的工程菌，培养至OD600值为2.5～4.0，得种子液；(2)取种子液，加入发酵培养基中培养，至溶氧值及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值大于10％/min时，补料；(3)当OD600值为20～30时进行诱导表达，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，降温至30℃，继续补料，培养至OD600值为70～90。本发明可大幅提高含可溶性乳酸脱氢酶突变体宿主菌的收获水平，且发酵工艺简便，成本低廉，可应用于大规模生产制备乳酸脱氢酶突变体，有很好的应用前景。

公开(公告)号：CN109280651A

公开(公告)日：2019-01-29

申请号：CN201811069893.X

申请日：2018-09-13

申请人： 四川自豪时代药业有限公司

发明人： 魏琪 ,  邱鹏 ,  蒋飞 ,  张骞 ,  王洪 ,  罗红

IPC分类号： C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。该发明依赖于遗传资源Lactobacillus bulgaricus的乳酸脱氢酶基因，在此基础上进行点突变并对基因序列进行密码子优化后，连接到表达载体上，构建重组质粒并导入大肠杆菌中，重组乳酸脱氢酶突变体在大肠杆菌中获得了可溶性高表达，离心收集的菌体经高压均质机破菌后，粗酶液可在低温下存放5天，活性无明显衰减。通过本方法制备的重组乳酸脱氢酶突变体与未进行突变及序列优化的重组乳酸脱氢酶相比，表达量提高了五倍以上，且在高pH值下的活性损失更小，有更广的pH值适用范围。本发明在乳酸发酵制备及NAD/NADH循环中有广阔的应用前景。