公开(公告)号：CN117187221A

公开(公告)日：2023-12-08

申请号：CN202311055990.4

申请日：2023-08-22

申请人： 武汉大学

发明人： 袁必锋 ,  谢能彬 ,  王敏

IPC分类号： C12N9/78 ,  C12P17/12 ,  C12Q1/686 ,  C12Q1/6869

摘要： 本发明公开了一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5‑羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，属于生物技术领域。本发明利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A‑v1蛋白实现对DNA中不同序列特征的胞嘧啶(C)和5‑甲基胞嘧啶(5mC)可以有效的脱氨基，而其对不同序列特征的5‑羟甲基胞嘧啶(5hmC)不脱氨基的策略，随后进行通过聚合酶链式反应扩增并通过对扩增产物测序的方法获得5‑羟甲基胞嘧啶的位点信息。本发明方法灵敏度高、选择性高、操作简便，不涉及亚硫酸氢盐处理且无需其他生物酶介导，可以直接获得DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位信息。

公开(公告)号：CN114774399A

公开(公告)日：2022-07-22

申请号：CN202210304239.2

申请日：2022-03-25

申请人： 武汉大学

发明人： 袁必锋 ,  谢能彬

IPC分类号： C12N9/78 ,  C12Q1/6869

摘要： 本发明公开了人工改造脱氨酶辅助的DNA中5‑羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，属于生物技术领域。本发明利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A‑1及eA3A‑2蛋白分别对DNA中不同序列特征的胞嘧啶和5‑甲基胞嘧啶有效的脱氨基，而其对不同序列特征的5‑羟甲基胞嘧啶不脱氨基的策略，随后进行聚合酶链式反应扩增进而测序获得5‑羟甲基胞嘧啶的位点信息。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，无需亚硫酸氢盐的处理，亦无须对5‑羟甲基胞嘧啶进行糖基化保护，就可以直接获得DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。

公开(公告)号：CN115725703A

公开(公告)日：2023-03-03

申请号：CN202211552186.2

申请日：2022-12-05

申请人： 武汉大学

发明人： 袁必锋 ,  季彤彤 ,  谢能彬

IPC分类号： C12Q1/6851 ,  C12Q1/6883

摘要： 本发明公开了一种特异性酶切结合qPCR单碱基分辨定量检测DNA中尿嘧啶的方法，属于生物技术领域。本发明基于UdgX‑H109S能够识别并切割尿嘧啶(U)产生无嘌呤位点(AP)，无嘌呤核酸内切酶1(APE1)切割产生的AP位点，产生1个核苷酸间隙，导致Bst 3.0DNA聚合酶的延伸停止。实时荧光定量PCR(qPCR)技术可以放大延伸产物的差异，进而直接检测特定位点尿嘧啶的含量。本发明方法灵敏度高，特异性好，操作简单，效率高，不仅可以用于低丰度生物样品中尿嘧啶的单碱基分辨率测定，同时为研究尿嘧啶在生物体中的功能提供了新方法。

公开(公告)号：CN114774399B

公开(公告)日：2024-01-30

申请号：CN202210304239.2

申请日：2022-03-25

申请人： 武汉大学

发明人： 袁必锋 ,  谢能彬

IPC分类号： C12N9/78 ,  C12Q1/6869

摘要： 本发明公开了人工改造脱氨酶辅助的DNA中5‑羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，属于生物技术领域。本发明利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A‑1及eA3A‑2蛋白分别对DNA中不同序列特征的胞嘧啶和5‑甲基胞嘧啶有效的脱氨基，而其对不同序列特征的5‑羟甲基胞嘧啶不脱氨基的策略，随后进行聚合酶链式反应扩增进而测序获得5‑羟甲基胞嘧啶的位点信息。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，无需亚硫酸氢盐的处理，亦无须对5‑羟甲基胞嘧啶进行糖基化保护，就可以直接获得DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。

公开(公告)号：CN118207194A

公开(公告)日：2024-06-18

申请号：CN202410183776.5

申请日：2024-02-19

申请人： 武汉大学

发明人： 袁必锋 ,  王敏 ,  谢能彬

IPC分类号： C12N9/78 ,  C12Q1/6869

摘要： 本发明公开了一种人工改造胞嘧啶脱氨酶及DNA中5‑甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法，涉及生物技术领域。本发明利用双加氧酶nTET蛋白，特异性地将5‑甲基胞嘧啶氧化为5moC(包括5hmC、5fC、5caC)，使得在人工改造胞嘧啶脱氨酶A3Am蛋白处理后，不同序列特征的5moC能够拮抗脱氨基，在随后的聚合酶链式反应扩增中扩增为胞嘧啶，而不同序列特征的胞嘧啶能够被A3Am完全脱氨基，在随后的聚合酶链式反应中扩增为胸腺嘧啶。因此，在最终的测序中只有5‑甲基胞嘧啶被读作胞嘧啶。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，不涉及亚硫酸氢盐处理，可直接获得DNA中5‑甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。

公开(公告)号：CN118028272A

公开(公告)日：2024-05-14

申请号：CN202410113179.5

申请日：2024-01-26

申请人： 武汉大学

发明人： 袁必锋 ,  谢能彬 ,  王敏

IPC分类号： C12N9/78 ,  C12Q1/6869

摘要： 本发明公开了一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中特定位点胞嘧啶、5‑甲基胞嘧啶和5‑羟甲基胞嘧啶同时定量分析方法，属于生物技术领域。本发明利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A‑M1蛋白实现对DNA中胞嘧啶(C)完全脱氨基、对5‑甲基胞嘧啶(5mC)部分脱氨基、对5‑羟甲基胞嘧啶(5hmC)不脱氨基，随后进行PCR扩增并对扩增产物测序获得5mC的脱氨基率和待测位点的整体脱氨基率，并通过计算直接获得待测位点C、5mC和5hmC的含量信息。本发明方法灵敏度高、选择性高、操作简便，不涉及亚硫酸氢盐处理且无需其他生物酶介导，可以直接获得DNA中特定位点C、5mC和5hmC的定量信息。