本发明公开了一种利用万寿菊颗粒制备全反式叶黄素酯粉末的分离纯化方法。该方法包括将万寿菊颗粒与非极性溶剂混合后，进行连续逆流超声提取得到浸提液，浸提液浓缩得到叶黄素酯粗提物，粗提物用溶剂溶解后用氧化铝柱层析，得到高纯度的叶黄素酯产品。本发明的优点在于采用连续逆流超声提取叶黄素酯，批处理量大，溶剂用量小且回收率高，同时降低了人工费用和动力费用，首次将氧化铝柱用于叶黄素酯的层析分离，解决了直接从万寿菊粗提物中纯化叶黄素酯的技术问题，可以制备HPLC含量大于95%的全反式叶黄素酯产品，总类胡萝卜素收率达到80%以上。