本发明公开了一种利用游动放线菌(Actinoplanessp.)发酵培养物制备雷莫拉宁三种单组份的制备方法。该方法包括将雷莫拉宁发酵液通过大孔脱色树脂脱色后，再用大孔吸附树脂吸附、解吸，浓缩后得到含有三种单组份A1、A2、A3的雷莫拉宁粗提物。对粗提物再用溶剂溶解后借助聚合物微球进行层析分离，得到高纯度的雷莫拉宁三种单组份A1、A2及A3产品。本发明的优点在于使用聚合物微球对该产品进行层析分离时，样品处理量大，得到的单组份纯度高。因聚合物微球介质的价格为反相硅胶C18的30%，且分离效果相当，从而大大降低了制备成本。