本发明公开了一种利用丝状真菌(Tolypocladium inflatum)发酵培养物制备环孢菌素A衍生物的方法。该方法包括使用助滤剂，经过过滤、脱色、吸附、结晶等步骤，得到环孢菌素A衍生物的粗提物，再借助聚合物微球对粗提物进行层析分离，得到高纯度的环孢菌素A衍生物产品。本发明的优点在于采用大孔树脂提取分离环孢菌素A衍生物，工艺简单易行，适宜于工业化规模生产；并首次将聚合物微球用于该产品的层析分离，可以制备高纯度的环孢菌素A衍生物产品。