本发明公开了一步法快速构建扩增子文库的方法，包括以下步骤：1、合成用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，所述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合包括：根据目标扩增子设计的上游融合引物，根据目标扩增子设计的下游融合引物，上游通用引物和下游通用引物；2、构建DNA样品的PCR反应体系；3、进行PCR。运用该方法可以简便、快速的经1步构建扩增子文库，且由于在PCR起始前就引入barcode，使得样本及文库间交叉污染的可能性大大降低。