本发明提供一种纽莫康定B0的纯化方法，该方法先从发酵液菌渣中萃取纽莫康定B0粗品，粗品经膜过滤处理后，向过滤液中加入吸附剂以形成吸附有纽莫康定B0的固形物，并对固形物进行CO2超临界流体萃取，再向所得萃取液中加入溶剂析晶，最后以HILIC模式反相硅胶键合填料为固定相，乙醇水溶液为流动相，对晶体进行柱层析分离，收集富含纽莫康定B0的流出液，即得纯品纽莫康定B0；该方法能够很好地实现PB0和PC0的分离，稳定高效地得到纽莫康定B0，其HPLC纯度可达99.4％以上，异构体PC0的HPLC纯度低至0.01‑0.04％，与现有提纯方法相比，本发明具有工艺操作简便，产品品质佳的优势。