本发明公开了一种重组肌红蛋白的制备方法。所述方法先通过在pH＝2.0的酸性条件下，蛋白质变性导致卟啉分离制备脱辅基肌红蛋白，再通过pH＝9.5的碱性条件下，脱辅基肌红蛋白复性与锌卟啉的结合制备重组蛋白。本发明制备方法工艺简单、易于控制，制得的重组肌红蛋白对于肌红蛋白能够发出稳定的较强的荧光，其荧光强度要远远强于原肌红蛋白。利用重组肌红蛋白可以制备荧光生物传感器，具有灵敏度高、选择性好等优点，可应用于生物医学研究、环境监测等领域。