本发明公开了一种底物特异性提高的苯丙氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的苯丙氨酸脱氢酶突变体对苯丙酮酸的底物特异性较野生型有了明显的改善，同时，对L‑正缬氨酸、L‑亮氨酸、L‑缬氨酸、L‑苯甘氨酸的特异性较野生型有了明显的降低，因此，将本发明的苯丙氨酸脱氢酶突变体用于血液等样品中苯丙氨酸含量的检测时，可排除其他氨基酸的干扰，提高检测灵敏度，在制备苯丙氨酸检测试剂盒以及苯丙酮尿症检测试剂盒方面具有极高的应用前景。