本发明涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白重构体及其制备方法和应用。所述猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码该中和抗原表位融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明分别选取PEDV、TGEV、PoRV的主要中和抗原表位基因并进行拼接，而后通过重组杆状病毒真核表达系统对串联基因进行融合蛋白表达。将表达串联基因融合蛋白的重组病毒通过腹腔注射的方式免疫小鼠，可诱导机体产生免疫应答，具有较强的免疫原性。本发明为预防PEDV、TGEV、PoRV感染提供了一种新的方法，也为猪腹泻病毒新型疫苗的开发奠定了基础。