本发明公开了一种嵌合型基因I型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明的嵌合型病毒样颗粒为基于基因I型乙型脑炎病毒病毒样颗粒的重组猪瘟病毒中和表位嵌合抗原蛋白，编码该病毒样颗粒的DNA片段的核苷酸序列如SEQ#ID#NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ#ID#NO.2所示；将SEQ#ID#NO.1所示DNA片段克隆到真核表达载体pVAX1中构建重组表达质粒；将重组表达质粒转染BHK‑21细胞，收集转染细胞的细胞培养上清，浓缩纯化后获得递呈猪瘟病毒中和抗原表位的嵌合型基因I型乙型脑炎病毒病毒样颗粒。本发明的病毒样颗粒能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，可用于猪场猪瘟病毒和流行性乙型脑炎病毒感染的免疫预防，用于制备猪瘟病毒和流行性乙型脑炎病毒疫苗。