本发明涉及异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸合成中的应用。该异亮氨酸羟化酶突变体是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位、56位、88位、123位、135位、138位、155位、162位、176位、179位、182位、196位、205位、226位、228位、234位和236位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。与野生型异亮氨酸羟化酶相比，本发明所述异亮氨酸羟化酶突变体对底物异亮氨酸的活力有大幅度提高，所述异亮氨酸羟化酶突变体可用于高效制备糖尿病治疗药物(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸，具有很好的工业应用前景。