本发明涉及一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用。所述β冠状病毒抗原的氨基酸序列按照从N端到C端的顺序包括：按照(A‑B)‑(A’‑B’)样式排列的氨基酸序列或(A‑B)‑C‑(A’‑B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A‑B表示来自β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，A’‑B’表示来自另一种β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，所述β冠状病毒抗原为单链异源二聚体结构。使用该β冠状病毒抗原获得了一种β冠状病毒二联疫苗，该二联疫苗能够刺激小鼠产生强烈的抗体反应。