本发明提供一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的靶点位于ETH_00009555基因，可以进行精确的基因定点突变；由sgRNA、Cas9和同源重组片段建立基因编辑系统，可精确地将目的片段同源重组于ETH_00009555基因；构建一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的球虫载体，所述重组球虫载体的DNA中成功重组了目的基因，且在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白。