本发明公开了一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用。具体为应用反向遗传操作技术，对信鸽新城疫病毒株(PNDV‑YQ株)的F蛋白3个裂解位点的氨基酸进行了定点突变，通过分段克隆的方式构建并获得了低毒力基因的全长cDNA质粒pOK‑YQ，再分别将PNDV‑YQ株的NP、P和L的ORF基因克隆至真核表达载体pCIneo，构建并获得了辅助质粒pCI‑NP，pCI‑P，pCI‑L。全长质粒与辅助质粒共转染BSR‑T7细胞后，拯救出重组致弱病毒，即鸽新城疫病毒(PNDV‑aYQ株)。该株病毒为低致病性或无致病性毒株，且具有良好的增殖特性和遗传特性稳定。以该病毒株制备的灭活疫苗，与现有鸡新城疫疫苗相比，该疫苗具有副反应低、免疫产生期早和保护率高的优点。