本发明公开了一种岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，包括：采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因，以获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系；其中，外显子区域片段包含如SEQ ID NO.1所示的序列；三种sgRNA的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明创造性地采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组以敲除CHO细胞的FUT8基因，显著提高sgRNA的打靶效率，进而显著提高了FUT8基因的敲除效率，更容易获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。