本发明公开了一种高通量酵母双杂交文库筛选方法。属于分子生物技术领域。该方法包括如下步骤：酵母诱饵菌株的制备；酵母诱饵菌株与文库菌的杂交；交配后培养物的培养与检测：将交配后培养物置于半固态培养基中，冰上培养，使液态培养基凝固成半固态胶冻状，之后培养收集酵母细胞，并提取酵母细胞质粒进行PCR扩增，凝胶电泳检测。该方法采用半固态凝胶培养基培养来代替经典方法中涂板培养的步骤，缩减了工作量，也免去挑选单克隆进行检测时的大量重复操作。