本发明涉及基因工程和生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种在无人工DNA模板的前提下，在生物体内创制新基因的方法及应用。所述方法是通过在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。本发明新基因能够改变生物体的生长、发育、抗性、产量等性状，具有重大应用价值。