本发明提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用，涉及分子生物学与合成生物学技术领域。本发明提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌Synbio‑Sc1、Synbio‑Sc2和Synbio‑Sc3。经实验证实，本发明的基因工程酵母菌能够高效组装高达60kb的大片段DNA，组装效率高达63.5％～93.8％，极大的提升了大片段DNA的组装效率和合成上限，同时也可降低生产成本，对于基因合成与合成生物学DNA构建的工业研究与生产具有重要意义。