本发明涉及一种具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法及应用，属于海洋生物医药领域。所述具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法，包括匀浆、酶解、纳滤脱盐、超滤分离、浓缩和冷冻干燥等步骤。本发明采用生物酶解、超滤分离的方法，得到大量乌贼总酶解产物及目标分子量酶解产物，操作简单，生产条件温和，可满足大规模生产的需要；所得乌贼酶解产物具有高活性、易储存等特点；通过细胞实验，结果显示乌贼酶解产物对人成骨样MG‑63细胞和人骨髓间充质干细胞HBMSCs的增殖具有促进作用，说明乌贼酶解产物具有一定的成骨活性，可用于制作具有成骨活性的功能性食品或药品。