本发明涉及一种烟草全基因组SNP位点组合、探针、芯片及其应用，所述应用包括基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定中的任一项；所述烟草全基因组SNP位点组合包括18981个SNP位点，所述18981个SNP位点的物理位置是基于烟草品种K326基因组序列比对确定的；所述18981个SNP位点的物理位置信息见表1。本发明能够进行烟草种质资源或育种群体材料规模化、高通量、低成本的基因分型检测工作，满足烟草种质资源鉴定及进一步育种利用的需求，加快烟草种质资源利用和分子育种的选择效率。