本发明公开了一种氨苄西林钠杂质及其制备方法，属于药物杂质制备技术领域，该化合物中文名为2‑[3,3‑二甲基‑7‑氧代‑6‑（2,2,3‑三氨基‑3‑苯基丙酰胺基）‑4‑噻‑1‑氮杂双环[3.2.0]庚烷‑2‑羰基氧基]‑2‑苯基乙酸钠，制备方法：以氨苄西林无水酸为原料溶解于混合溶剂中，用氨水调pH，加热反应；反应结束，反应液抽滤，取滤液，用甲酸调pH，加入水和有机溶剂萃取，有机相经洗涤干燥后，减压浓缩，得到黄色固体即RRT4.3杂质粗品；在经过色谱分离、真空冷冻干燥得到该杂质纯品。本发明制得的杂质可用于氨苄西林钠杂质的定性及定量分析，对氨苄西林钠的质量控制起到重要作用。