本发明公开了一种A型口蹄疫疫苗抗原定量检测ELISA试剂盒、检测方法及其应用。所述的试剂盒中含有A型口蹄疫病毒的特异性抗体Ab3，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。所述的抗原包括A型口蹄疫病毒146S抗原以及口蹄疫病毒样颗粒。此外，本发明还建立了一种定量检测A型口蹄疫疫苗中抗原含量的方法，该方法是以A型口蹄疫病毒的特异性抗体Ab3为包被抗体，生物素化标记的Ab3抗体为检测抗体，HRP标记的链霉亲和素作为酶标二抗，同时使用A型口蹄疫病毒灭活146S抗原标准品制作标准曲线，建立的双抗体夹心ELISA方法，该方法具有较高的特异性和重复性，且相比较传统蔗糖密度梯度离心法，操作更简易，不需要大型仪器设备，更适合临床推广。