本发明公开了一种利用米曲霉生产高酶活力蛋白酶的一次补水培养方法，属于生物技术领域，该方法包括（1）备料：原料麦麸与水的比例为1：0.7～1.3(w/w)（2）高温灭菌（3）接种：按原料计接种量为2～3%（4）初始发酵：固态发酵培养20～24小时（5）一次补水：发酵培养20～24小时开始补水，补水后培养基料水分含量为61～75%，产酶Aw水活度为0.81～0.93（6）补充空气，使氧气浓度达到19.9～20.9%VOL（7）继续发酵24～30小时（8）冷却至20℃出料。本发明方法采用的一次补水工艺，操作简单，生产效率高；通过对发酵过程中一次补水工艺前后各相关联的工艺参数进行优化与有效控制，很大地提高了所产蛋白酶的酶活力和产率，产品稳定性好，能较大地降低生产成本。