本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法及其应用。提供一种鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法，其包括：a)基于外源导入片段两端的核苷酸序列设计并合成两个引物对，第一引物对能够特异性扩增外源导入片段左端的特征序列；第二引物对能够特异性扩增外源导入片段右端的特征序列；b)以含有外源导入片段的待测生物体的基因组DNA为模板，使用第一引物对、第二引物对和KASP预混液进行PCR；c)PCR结束后，根据扩增产物的荧光信号判断待测生物体中外源导入片段是否缩短。该方法具有准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，适用于大规模育种筛查。