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公开(公告)号：CN103789246A
公开(公告)日：2014-05-14
申请号：CN201410005932.5
申请日：2014-01-03
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明公开了一种透性化谷氨酸脱羧酶工程菌及其制备方法，所述方法包括：将已表达谷氨酸脱羧酶的谷氨酸脱羧酶工程菌菌体悬浮于水或缓冲液中，50～70℃处理5～40min后，收集菌体，得到所述的透性化谷氨酸脱羧酶工程菌；其中，所述的谷氨酸脱羧酶工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的谷氨酸脱羧酶基因，所述的宿主细胞为大肠杆菌。本发明还提供了所述方法得到的透性化谷氨酸脱羧酶工程菌。本发明的方法，简便、成本低，易于操作，可有效提高菌体的谷氨酸脱羧酶表观催化活力。
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公开(公告)号：CN103773731A
公开(公告)日：2014-05-07
申请号：CN201410005648.8
申请日：2014-01-03
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明公开了一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法，包括：将谷氨酸脱羧酶重组工程菌接种至培养基中，振荡培养，获得种子液；将种子液接种至培养基中，振荡培养至OD600为0.6～0.8时，加入诱导剂进行诱导培养，加入诱导剂的同时向培养基中加入细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂来干扰重组菌细胞壁或（和）细胞膜的合成，达到增强菌体通透性、提高菌体表观催化活力的目的；诱导培养结束后收集菌体，即得到表观催化活力提高的谷氨酸脱羧酶重组工程菌。本发明避免了常规菌体培养后再进行透性化处理所需的多步工艺步骤，为改善高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力提供一种简便、高效和低成本的方法。
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公开(公告)号：CN103773819B
公开(公告)日：2016-05-18
申请号：CN201410005905.8
申请日：2014-01-03
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明公开了一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法，包括：将米根霉接入发酵培养基中进行发酵，当发酵液的pH小于4.8时，向发酵液中加入谷氨酸脱羧酶、磷酸吡哆醛和L-谷氨酸钠，之后持续向发酵液中加入L-谷氨酸钠，利用谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成GABA的活力，消耗环境中的H+，使发酵液的pH维持在4.8～6.0，达到解除酸抑制对乳酸发酵的抑制、实现乳酸与GABA的同时生产的目的。本发明为乳酸发酵提供了一种新的解除底物抑制的方法，并且在发酵过程中耦合产生功能化合物γ-氨基丁酸，不仅增加了乳酸的产量，而且提高了过程的经济性。
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公开(公告)号：CN104694524A
公开(公告)日：2015-06-10
申请号：CN201510097873.3
申请日：2015-03-05
申请人： 浙江大学宁波理工学院
CPC分类号： C12N9/88 , C12P13/00 , C12Y401/01015
摘要： 本发明公开了一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体，该方法包括：构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点；针对该位点设计定点突变引物，以谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，获得定点突变文库；从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。该方法通过拉氏图提供的结构信息对酶进行理性设计，并结合定点突变技术，有效提高突变概率，节省时间，提高实验效率，并筛选得到催化活力优于野生型酶的突变酶，该突变酶可提高催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的反应速率，有利于GABA的工业化生产。
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公开(公告)号：CN103773819A
公开(公告)日：2014-05-07
申请号：CN201410005905.8
申请日：2014-01-03
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明公开了一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法，包括：将米根霉接入发酵培养基中进行发酵，当发酵液的pH小于4.8时，向发酵液中加入谷氨酸脱羧酶、磷酸吡哆醛和L-谷氨酸钠，之后持续向发酵液中加入L-谷氨酸钠，利用谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成GABA的活力，消耗环境中的H+，使发酵液的pH维持在4.8～6.0，达到解除酸抑制对乳酸发酵的抑制、实现乳酸与GABA的同时生产的目的。本发明为乳酸发酵提供了一种新的解除底物抑制的方法，并且在发酵过程中耦合产生功能化合物γ-氨基丁酸，不仅增加了乳酸的产量，而且提高了过程的经济性。
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公开(公告)号：CN103031323A
公开(公告)日：2013-04-10
申请号：CN201110297904.1
申请日：2011-09-30
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60℃和70℃下的热稳定性。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
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公开(公告)号：CN103031322A
公开(公告)日：2013-04-10
申请号：CN201110297156.7
申请日：2011-09-30
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因，其核苷酸序列在第311位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60℃和70℃下的热稳定性。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
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公开(公告)号：CN102080090A
公开(公告)日：2011-06-01
申请号：CN201010567447.9
申请日：2010-11-17
申请人： 浙江大学宁波理工学院
摘要： 本发明公开一种短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用。该基因来自短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306，全长1407bp，通过PCR从短乳杆菌基因组DNA中扩增获得。在该基因两端分别加上BamH I和EcoRI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET-28a(+)连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)，实现了在大肠杆菌中的重组表达，表达产物谷氨酸脱羧酶分子量为53538.6Da。该重组谷氨酸脱羧酶或表达该重组酶的工程菌可将L-谷氨酸或其盐脱羧转化为γ-氨基丁酸，具有转化效率高、产物纯度高，生产效率高的优点。
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