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公开(公告)号：CN102851252B
公开(公告)日：2014-11-26
申请号：CN201210274174.8
申请日：2012-08-03
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种产维生素C合成中间体山梨酮的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。本发明通过基因工程技术，将来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脱氢酶基因(sdh)克隆到氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)中，获得了一株利用山梨醇生产山梨酮的G.oxydans工程菌。G.oxydans WSH-003是二步发酵法生产2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)过程中第一步发酵工业菌株，由江苏江山制药有限公司提供。将sdh克隆到G.oxydans中，实现了从D-山梨醇到维生素C合成中间体山梨酮的转化，为进一步构建一步发酵工程菌生产维生素C直接前体2-KLG奠定了基础，山梨酮的产量可达72g/L，具有很好的应用前景。
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公开(公告)号：CN103923847A
公开(公告)日：2014-07-16
申请号：CN201410093771.X
申请日：2014-03-14
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母，属于代谢工程技术领域。本发明通过过量表达PDA1提高细胞内丙酮酸脱氢酶E1组分催化活力，不仅使中间代谢产物丙酮酸积累量下降，强化了细胞内乙酰-CoA供应；而且为细胞累积α-酮戊二酸提高了细胞内乙酰-CoA供应，致使细胞外积累的α-酮戊二酸明显提高。因此，过量表达PDA1不仅降低了中间代谢产物丙酮酸含量，并且强化了α-酮戊二酸积累，为细胞积累TCA循环中的有机酸提供了新思路。
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公开(公告)号：CN102586128B
公开(公告)日：2014-04-09
申请号：CN201210066444.6
申请日：2012-03-14
Applicant: 江南大学 , 宜兴协联生物化学有限公司
Abstract: 本发明公开了一种通过强化丙酮酸羧化途径促进α-酮戊二酸积累的方法，将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)中编码丙酮酸羧化酶的基因RoPYC2过量表达于发酵法生产α-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，获得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重组菌，其丙酮酸羧化酶活性提高了10.2倍(达到0.87U/mg protein)；以甘油为唯一碳源，发酵144h后，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，是出发菌株的1.3倍；丙酮酸产量降低到10.4g/L，是出发菌株的49.0％。本发明通过调控三羧酸循环的回补途径，成功实现了碳代谢流从丙酮酸节点流向α-酮戊二酸节点，在提高α-酮戊二酸产量的同时，减少了副产物-丙酮酸的生成。为今后利用代谢工程手段改造菌株促进目标产物过量积累提供了一定的借鉴意义。
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公开(公告)号：CN103484391A
公开(公告)日：2014-01-01
申请号：CN201310481832.5
申请日：2013-10-15
Applicant: 江南大学
CPC classification number: C12P7/50 , C07K14/39 , C12N1/16 , C12N15/815
Abstract: 本发明公开了一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌，属于代谢工程领域。本发明从Yarrowia lipolytica CLIB122全基因组范围内的6611条蛋白质编码序列中筛选得到4条编码转运蛋白的基因，通过在解脂亚洛酵母（Y.lipolytica）WSH-Z06中分别过量表达这4个基因，获得了细胞外α-酮戊二酸含量提高的重组菌。本发明通过过量表达这类基因增强了细胞将α-酮戊二酸转运至细胞外能力，降低下游分离纯化成本。
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公开(公告)号：CN103388011A
公开(公告)日：2013-11-13
申请号：CN201310322143.X
申请日：2013-07-29
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，以固定化基因工程菌为生产种子，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30℃、200rpm条件下增殖培养20-24h；按15%的接种量将培养好的固定化种子接入发酵培养基，30℃，500rpm，2.5vvm，1-L发酵罐条件下半连续补料发酵21天。应用上述方法以山梨醇为唯一碳源，发酵16h后，D-山梨醇转化率达到90%以上，与对照菌株相比提高了37%；以山梨醇为唯一碳源，可完成21天的固定化细胞的半连续补料发酵，与游离菌发酵相比节约20批次的种子制备成本。
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公开(公告)号：CN102943089A
公开(公告)日：2013-02-27
申请号：CN201210528327.7
申请日：2012-12-10
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种蛋白质泛素化快速检测载体及其应用，属于分子生物学领域。该质粒以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒pY26为基础，可以方便地在大肠杆菌中扩增并在酿酒酵母中进行表达，过分别构建融合基因GN-UBI3、MCS-GC，并将其分别插入基础质粒pY26的两组启动子-终止子之间构建得到检测质粒pYL16。使用者只需将待研究蛋白质的表达基因插入至MCS即可实现共表达质粒的构建。将其在酿酒酵母中表达并在荧光显微镜下观察，根据荧光产生情况即可判断待研究蛋白质是否受到泛素化修饰。利用该检测系统，可将蛋白质泛素化的检测周期从现有方法的45天左右减少至10天。
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公开(公告)号：CN102676551A
公开(公告)日：2012-09-19
申请号：CN201210167512.8
申请日：2012-05-26
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，该基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大肠杆菌表达系统进行了表达，DCIP法检测表达产物具有酶活性，且具有山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶双功能作用，可用于将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG），并且可与本研究中的L-山梨酮脱氢酶协同进行由L-山梨糖至2-KLG的转化。
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公开(公告)号：CN102653767A
公开(公告)日：2012-09-05
申请号：CN201210167614.X
申请日：2012-05-26
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，该基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大肠杆菌表达系统进行了表达，DCIP法检测表达产物具有酶活性，且具有山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶双功能作用，可用于将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG），并且可与本研究中的L-山梨酮脱氢酶协同进行由L-山梨糖至2-KLG的转化。
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公开(公告)号：CN102586347A
公开(公告)日：2012-07-18
申请号：CN201210056106.4
申请日：2012-03-06
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种两阶段pH控制高产α-酮戊二酸的方法，属于发酵工程领域。本发明采用两阶段控制pH调控发酵过程，以解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)CCTCC NO.M207143为生产菌株，发酵前期以CaCO3为pH缓冲剂，后期用NaOH维持pH＝2.5，大量积累α-酮戊二酸，实验室规模α-酮戊二酸产量达到53.4g/L，比恒定pH＝2.5时，α-酮戊二酸产量提高了142.7％；比仅用CaCO3为pH缓冲剂，α-酮戊二酸产量提高了32.5％；发酵后期低pH值能降低染菌的概率，减少NaOH用量，利于下游产品的提取；具有广阔的工业应用前景。
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公开(公告)号：CN101240250B
公开(公告)日：2011-10-05
申请号：CN200810018666.4
申请日：2008-03-07
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明为一种选育大片段缺失的无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的系统方法，主要包括融合PCR方法得到大片段缺失的同源重组片段，高效率酵母电转化感受态的制备，制霉菌素富集和限制性培养基筛选。通过一整套系统方法，可以在3-5天内快速的得到目的营养缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回复突变和与外源质粒的同源重组。此外，由于在整个过程中未使用任何抗性标记，使用该方法还可以在同一出发菌株上使用多次，得到多重营养缺陷型，供后续基因工程研究使用。
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