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公开(公告)号：CN104894071A
公开(公告)日：2015-09-09
申请号：CN201510311719.1
申请日：2015-06-08
申请人： 东华大学
摘要： 本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。本发明在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响，具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN104215471A
公开(公告)日：2014-12-17
申请号：CN201410469178.0
申请日：2014-09-15
申请人： 东华大学
IPC分类号： G01N1/06
摘要： 本发明涉及一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，包括：载玻片洁净处理，然后取洁净的载玻片，朝上面标记，滴加200ul浓度为0.1mg/ml多聚赖氨酸工作液；另取载玻片标记面向下，在注有溶液的载玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直至标记处停止，平放，烘干，干燥后分开，得到防脱玻片；用冰冻切片包埋剂预先浸润组织表面，固定到切片托上，冷冻腔放置，待组织块至表面白色，全部冷冻后放入切片机冷冻夹上进行切片，即得。本发明中玻片易于标准化制作，操作简单，节约试剂，切片制作参数固定，特征明显，易于学习。
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公开(公告)号：CN104651401A
公开(公告)日：2015-05-27
申请号：CN201510098102.6
申请日：2015-03-05
申请人： 东华大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/65 , C12N15/113
摘要： 本发明涉及一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：构建两种针对mir-505基因的打靶载体，在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir-505基因进行替换敲除，利用G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞，并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir-505进行敲除，通过荧光筛选得到mir-505双等位基因敲除的细胞。本发明为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN104212836A
公开(公告)日：2014-12-17
申请号：CN201410478757.1
申请日：2014-09-18
申请人： 东华大学
IPC分类号： C12N15/85
摘要： 本发明涉及一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法，通过体外合成sgRNA的核苷酸单链，再经过处理得到插入片段，随后将sgRNA利用同源重组或T4连接插入到41824载体中或42230载体中，转化至大肠杆菌的感受态细胞，然后对载体进行菌落PCR检测和测序确认，得到表达载体，通过将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定利用CRISPR-Cas9系统对mir-505基因的剪切效率。本发明为如何选择sgRNA表达载体提供参考。
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公开(公告)号：CN104651401B
公开(公告)日：2019-03-08
申请号：CN201510098102.6
申请日：2015-03-05
申请人： 东华大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/65 , C12N15/113
摘要： 本发明涉及一种mir‑505双等位基因敲除的方法，包括：构建两种针对mir‑505基因的打靶载体，在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir‑505基因进行替换敲除，利用G418抗性筛选得到mir‑505单等位基因敲除细胞，并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir‑505进行敲除，通过荧光筛选得到mir‑505双等位基因敲除的细胞。本发明为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。
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