公开(公告)号：CN105950613A

公开(公告)日：2016-09-21

申请号：CN201610543258.5

申请日：2016-07-11

申请人： 江南大学

发明人： 康振 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  丁雯雯 ,  金鹏

IPC分类号： C12N15/10

CPC分类号： C12N15/1027 ,  C12Q2521/101 ,  C12Q2527/125 ,  C12Q2521/501

摘要： 本发明公开了一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，属于基因工程技术领域。本发明在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性‑退火‑切割‑连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在1.5h内一次可以实现2‑4个非磷酸化DNA片段的高效快速的无缝组装。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效组装上，可引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。

公开(公告)号：CN106497858B

公开(公告)日：2019-06-21

申请号：CN201611094235.7

申请日：2016-12-02

申请人： 江南大学

发明人： 康振 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  丁雯雯

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12P13/00 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了一种生产5‑氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pRSFDuet‑1‑hemA过量表达5‑氨基乙酰丙酸C4合成途径关键酶5‑氨基乙酰丙酸合酶hemA的基础上，将来源于大肠杆菌CoA合成途径中编码泛酸激酶的的基因coaA、编码磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脱羧酶的基因dfp、编码磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD，使用pUC19和pETDuet‑1载体共表达三个基因，构建重组菌株。通过摇瓶培养验证，共表达CoA途径基因的重组菌ALA产量均明显提高，其中产量最高为700mg/L，相对于对照提高约46％。

公开(公告)号：CN105802954A

公开(公告)日：2016-07-27

申请号：CN201610214900.5

申请日：2016-04-07

申请人： 江南大学

发明人： 康振 ,  陈坚 ,  金鹏 ,  堵国成 ,  丁雯雯

IPC分类号： C12N15/10

CPC分类号： C12N15/1024 ,  C12Q2521/501 ,  C12Q2521/101 ,  C12Q2531/113

摘要： 本发明公开了一种基于耐热DNA聚合酶和连接酶的体外快速无缝组装DNA的方法，属于基因工程技术领域。本发明在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性?退火?切割?连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在2h内一次可以实现2?6个片段的高效快速的无缝组装。此外，可通过在引物中引入兼并突变序列实现PCR扩增后获得含有不同突变区域的DNA片段，进而通过本组装方法实现对基因DNA的组装突变构建。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效进化改造上，引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。

公开(公告)号：CN105802954B

公开(公告)日：2020-12-01

申请号：CN201610214900.5

申请日：2016-04-07

申请人： 江南大学

发明人： 康振 ,  陈坚 ,  金鹏 ,  堵国成 ,  丁雯雯

IPC分类号： C12N15/10

摘要： 本发明公开了一种基于耐热DNA聚合酶和连接酶的体外快速无缝组装DNA的方法，属于基因工程技术领域。本发明在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性‑退火‑切割‑连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在2h内一次可以实现2‑6个片段的高效快速的无缝组装。此外，可通过在引物中引入兼并突变序列实现PCR扩增后获得含有不同突变区域的DNA片段，进而通过本组装方法实现对基因DNA的组装突变构建。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效进化改造上，引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。

公开(公告)号：CN106497858A

公开(公告)日：2017-03-15

申请号：CN201611094235.7

申请日：2016-12-02

申请人： 江南大学

发明人： 康振 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  丁雯雯

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12P13/00 ,  C12R1/19

CPC分类号： C12N9/1029 ,  C12N9/1205 ,  C12N9/1235 ,  C12N9/88 ,  C12P13/001 ,  C12Y203/01037 ,  C12Y207/01033 ,  C12Y401/01036

摘要： 本发明公开了一种生产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pRSFDuet-1-hemA过量表达5-氨基乙酰丙酸C4合成途径关键酶5-氨基乙酰丙酸合酶hemA的基础上，将来源于大肠杆菌CoA合成途径中编码泛酸激酶的基因coaA、编码磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脱羧酶的基因dfp、编码磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD，使用pUC19和pETDuet-1载体共表达三个基因，构建重组菌株。通过摇瓶培养验证，共表达CoA途径基因的重组菌ALA产量均明显提高，其中产量最高为700mg/L，相对于对照提高约46％。

公开(公告)号：CN105950613B

公开(公告)日：2020-06-09

申请号：CN201610543258.5

申请日：2016-07-11

申请人： 江南大学

发明人： 康振 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  丁雯雯 ,  金鹏

IPC分类号： C12N15/10

摘要： 本发明公开了一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，属于基因工程技术领域。本发明在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性‑退火‑切割‑连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在1.5h内一次可以实现2‑4个非磷酸化DNA片段的高效快速的无缝组装。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效组装上，可引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。