本发明涉及一种利用高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。通过重叠PCR技术实现定向进化，获得高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D；利用高活力磷脂酶A2和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS，首先磷脂酰胆碱和丝氨酸在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸，然后磷脂酰丝氨酸再与二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A2的催化下生成2-DHA-PS。该方法合成的产品中2-DHA-PS的相对含量较高，有效克服了现有合成方法的不足。