本发明公开了一种高效的CRISPR RNP和供体DNA共位介导的基因插入或替换方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)将供体DNA进行生物素标记，得到生物素标记的供体DNA；(2)将Cas9蛋白与单价链霉亲和素的融合蛋白，sgRNA和生物素标记的供体DNA混合均匀，静置，得到CRISPR RNP‑供体DNA复合体；(3)将CRISPR RNP‑供体DNA复合体进行细胞核转化，实现基因插入或替换。本发明中利用该融合蛋白能结合生物素标记供体DNA的特性，使CRISPR RNP和供体DNA共同出现在目标位点，实现供体DNA在目标位点的精准插入或对目标位点基因的精准替换，适用于农作物和家畜育种方面。