本发明公开了一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法。通过菌株分离、母种培养基筛选、培养条件筛选和代料培养基筛选实验，最终以PDA+棉籽壳粉培养基和PDA+麦草粉作为母种培养基，野生稠李蘑菇菌丝体生长速度最佳，分别为2.86 mm/d和3.08 mm/d，菌丝长势亦较强，显著优于其他种类培养基；同时筛选出满足要求的代料培养基2种，完全可以满足开展生物学研究的要求。本发明提供的野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法不仅解决了野生稠李蘑菇菌株在普通马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长缓慢，菌丝长势弱，不便于作为菌种进行人工驯化栽培研究的技术问题，而且为野生稠李蘑菇菌种开展人工驯化栽培奠定了技术基础。