一种基于三氮唑活性分子的光亲和探针分子及其制备方法和应用，三氮唑活性分子和丁二酸酐在乙腈中搅拌得到带有单羧酸的中间产物；含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体与带有单羧酸的中间产物在EDC·HCl的缩合作用下，得到基于三氮唑活性分子的光亲和探针分子。本发明的三氮唑活性分子的光亲和探针分子制备方法简单，易于实现，并且收率较高。本发明的三氮唑活性分子的光亲和探针能够用于确证三氮唑活性分子的靶标蛋白以及验证光亲和标记技术在确证小分子靶标方面的可行性。