本发明涉及一种葡萄糖异构酶及其突变体，以及其编码基因，以及其在微生物催化D‑葡萄糖异构化制备高果糖浆F‑55中的应用。本发明提供的高效表达耐高温葡萄糖异构酶的重组大肠杆菌，解决了一般的耐高温葡萄糖异构酶生产高果糖浆F‑55反应温度过高的问题；应用该菌种生产葡萄糖异构酶具有产量高、工艺简单、周期短、便于工业化应用等优点，该菌株可直接用于高果糖浆F‑55的生产，而不需要细胞破碎；发酵培养结束后在80℃条件下对D‑葡萄糖的总酶活达到606.8U/g，D‑葡萄糖的转化率达到67.3％，80℃下保温24h残余酶活为75％，反应平衡时间为2.5h，这为高果糖浆F‑55的工业化大规模生产提供了良好的技术支持。