本发明涉及一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，先使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节其在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异，再根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。所述DNA测序方法只需要一路激发‑探测光路，不依赖复杂光路系统，这将减小测序设备中光路系统的复杂性。