公开(公告)号：CN115786295B

公开(公告)日：2025-04-25

申请号：CN202310035122.3

申请日：2023-01-10

Applicant: 浙江工业大学

Inventor： 柳志强 ,  朱芳莹 ,  张晓健 ,  郑垦 ,  郑裕国

IPC: C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P17/04 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种L‑泛解酸内酯脱氢酶、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯中的应用。所述L‑泛解酸内酯脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明挖掘的源自Pseudonocardia sp.73‑21的L‑泛解酸内酯脱氢酶具有严格的L‑立体选择性，本发明构建的重组大肠杆菌表达L‑泛解酸内酯脱氢酶具有良好的溶解性，避免了L‑泛解酸内酯脱氢酶异源表达容易形成大量包涵体的问题。本发明提供的L‑泛解酸内酯脱氢酶在生物催化制备酮基泛解酸内酯/D‑泛解酸内酯中具有应用价值。

公开(公告)号：CN117603935A

公开(公告)日：2024-02-27

申请号：CN202311312527.3

申请日：2023-10-11

Applicant: 浙江工业大学

Inventor： 柳志强 ,  朱芳莹 ,  张晓健 ,  黄梦钰 ,  郑垦 ,  郑裕国

IPC: C12N9/10 ,  C12N15/70 ,  C12N15/54 ,  C12N1/21 ,  C12P17/12 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种ω‑转氨酶突变体及其编码基因与应用。本发明构建的ω‑转氨酶嵌合体MwTAMc对底物前西他列汀酮第一次出现催化活性，且表现出严格的(R)‑立体选择性。针对MwTAMc的酶活改造，获得一系列优势突变菌株。突变体MwTAM3、MwTAM4、MwTAM7和MwTAM8的比细胞活力较过表达嵌合体的菌株MwTAMc分别提高了11.28倍、20.33倍、42.33倍和278.48倍。其中，嵌合体和突变体催化2g/L前西他列汀酮时，底物转化率由MwTAMc的4.5％提高到MwTAM4的30.3％，以及MwTAM8的95.6％。最佳优势突变体MwTAM8基本实现了2g/L前西他列汀酮的全转化，具有一定的应用前景。

公开(公告)号：CN116083383A

公开(公告)日：2023-05-09

申请号：CN202310088946.7

申请日：2023-01-16

Applicant: 浙江工业大学

Inventor： 柳志强 ,  朱芳莹 ,  张晓健 ,  郑垦 ,  曹敏 ,  杨青 ,  郑裕国

IPC: C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P17/04 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种L‑泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯/D‑泛解酸内酯中的应用。所述L‑泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第156位、第224位、第164位进行单突变或多点联合突变获得。本发明构建的RhoLPLDH突变体菌株的比酶活较对照组提升显著，RhoLPLDH突变体与分子伴侣pGro7共表达进一步提高蓝了目的蛋白可溶性表达。本发明构建的RhoLPLDH突变体和pGro7共表达工程菌相较于出发菌株的比细胞活力也有显著提升。突变体特异性催化LPL，30小时底物转化率可达到94％，突变体在催化D,L‑PL底物时，48小时转化率可达到91.8％。突变体和共表达共轭聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的工程菌采用“双菌一锅法”催化D,L‑PL拆分制备DPL时，DPL收率可达到92.7％。

公开(公告)号：CN116218802A

公开(公告)日：2023-06-06

申请号：CN202310065551.5

申请日：2023-01-16

Applicant: 浙江工业大学

Inventor： 柳志强 ,  朱芳莹 ,  张晓健 ,  杨青 ,  郑垦 ,  郑裕国

IPC: C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P17/04 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种L‑泛解酸内酯脱氢酶及突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯/D‑泛解酸内酯中的应用。所述L‑泛解酸内酯脱氢酶源自Rhodococcus hoagii，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其经密码子优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明有益效果主要体现在：本发明转化所需的三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。本发明将中间产物酮泛解酸内酯KPL转化为DPL的过程中利用辅酶再生体系，通过将NADP+转化为NADPH，使得NADPH在体系中浓度相对稳定，转化能够高效进行。本方法具有专一性强、产物光学纯度高、有效控制KPL水解等优点，采用本方法制备DPL，添加LPL 200mM，36小时转化率达96.4％且没有KPL水解。

公开(公告)号：CN115786295A

公开(公告)日：2023-03-14

申请号：CN202310035122.3

申请日：2023-01-10

Applicant: 浙江工业大学

Inventor： 柳志强 ,  朱芳莹 ,  张晓健 ,  郑垦 ,  郑裕国

IPC: C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P17/04 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种L‑泛解酸内酯脱氢酶、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯中的应用。所述L‑泛解酸内酯脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明挖掘的源自Pseudonocardia sp.73‑21的L‑泛解酸内酯脱氢酶具有严格的L‑立体选择性，本发明构建的重组大肠杆菌表达L‑泛解酸内酯脱氢酶具有良好的溶解性，避免了L‑泛解酸内酯脱氢酶异源表达容易形成大量包涵体的问题。本发明提供的L‑泛解酸内酯脱氢酶在生物催化制备酮基泛解酸内酯/D‑泛解酸内酯中具有应用价值。

公开(公告)号：CN112662732A

公开(公告)日：2021-04-16

申请号：CN202011400326.5

申请日：2020-12-04

Applicant: 浙江工业大学

Inventor： 柳志强 ,  钟娜 ,  张博 ,  郑垦 ,  郑裕国

IPC: C12Q1/25 ,  G01N21/64

Abstract: 本发明涉及一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。本发明以谷氨酸棒杆菌的泛酸合成酶为靶蛋白，利用饱和突变PCR技术对泛酸合成酶基因进行定向进化，突变基因重组于表达载体pET‑28a(+)中，并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库。取β‑丙氨酸及衍生化试剂于酶标板孔中，随即置于酶标仪中检测在激发波长355nm，发射波长445nm条件下的荧光值随时间的变化，曲线中最大值关联β‑丙氨酸的浓度，得到β‑丙氨酸标准曲线。通过计算得到反应液中β‑丙氨酸的浓度，以β‑丙氨酸浓度的高低来筛选泛酸合成酶突变体，使有效性状的突变株得以快速筛选出来。将缩合反应液、泛酸合成酶突变体全细胞反应液，充分混匀，反应结束后，离心除去细胞沉淀，取上清液和衍生化试剂反应，随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化，本发明不受反应液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简便，便于推广应用。