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公开(公告)号：CN112877275A
公开(公告)日：2021-06-01
申请号：CN202110154125.X
申请日：2021-02-04
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要： 本发明公开了HDAC2基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC2进行基因敲除；发明人将用于敲除HDAC2的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆；提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了1个HDAC2基因发生纯合移码突变的细胞克隆；其中HDAC2‑KO‑B3在Cas9预定切割位置处有1个碱基的缺失。HDAC2敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC2敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC2，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。
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公开(公告)号：CN112852874A
公开(公告)日：2021-05-28
申请号：CN202110155142.5
申请日：2021-02-04
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/55 , C12N5/10 , C12N7/00 , C12Q1/70 , C12Q1/6851 , G01N33/569 , C12R1/91
摘要： 本发明公开了HDAC5基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC5进行基因敲除，将用于敲除HDAC5的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆。提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了1个HDAC5基因发生纯合移码突变的细胞克隆，其中HDAC5‑KO‑A2在Cas9预定切割位置处有13个碱基的缺失。HDAC5敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC5敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC5，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。
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公开(公告)号：CN117867171A
公开(公告)日：2024-04-12
申请号：CN202311707931.0
申请日：2023-12-13
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12Q1/70 , C12Q1/6844 , C12N15/11 , C12R1/93
摘要： 本发明公开了一种小反刍兽疫病毒的可视化RT‑LAMP检测方法，基于PPRV M基因建立了一种可视化环介导等温扩增检测方法。通过NCBI数据库选取和比对PPRV N和M基因序列，设计并筛选特异性引物，经温度、镁离子、dNTP、引物浓度等试验条件优化，建立了以中性红染料为显示剂、以病毒M基因为检测对象的PPRV可视化RT‑LAMP检测方法。可视化RT‑LAMP的检测最低限度为1.5×102copies，其灵敏度比RT‑PCR高1000倍，特异性与RT‑qPCR相当；临床样品检测表明，建立的可视化RT‑LAMP方法可在45min内完成检测，与商品化直接RT‑qPCR试剂盒检测结果一致，但较RT‑PCR和RT‑qPC R用时短且操作简单；本检测方法较RT‑PCR、ELISA等方法更为便携和快速，可解决技术与设备匮乏地区及现场快速的检测难题。
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公开(公告)号：CN112852874B
公开(公告)日：2023-05-23
申请号：CN202110155142.5
申请日：2021-02-04
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/55 , C12N5/10 , C12N7/00 , C12Q1/70 , C12Q1/6851 , G01N33/569 , C12R1/91
摘要： 本发明公开了HDAC5基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC5进行基因敲除，将用于敲除HDAC5的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆。提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了1个HDAC5基因发生纯合移码突变的细胞克隆，其中HDAC5‑KO‑A2在Cas9预定切割位置处有13个碱基的缺失。HDAC5敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC5敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC5，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。
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公开(公告)号：CN114540308A
公开(公告)日：2022-05-27
申请号：CN202111251883.X
申请日：2021-10-26
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要： 本发明公开了稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系及构建方法，以pAcBac1.tR4‑MbPyl质粒为模板，构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，分别经BamH I和Hind III、BamH I和Nhe I双酶切，连接到pCMV‑flag、pIRES‑puro3和pIRES‑puro3‑flag载体上，通过PCR反应、酶切、测序和Western‑blot鉴定，得到阳性克隆paaRS真核表达质粒；将paaRS、pCMV‑EGFP(pEGFP)和pCMV‑TAG‑EGFP(pTAG‑EGFP)质粒按不同组合转染BHK‑21细胞，进行筛选，通过绿色荧光检测和Western‑blot鉴定，挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶表达量最高的单克隆细胞系，成功构建并筛选出稳定表达正交系统的细胞系，BHK‑21细胞aaRS‑4‑8，保藏号为CCTCC N：C2021280；为下一步利用正交系统拯救TAG突变病毒奠定了实验基础。
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公开(公告)号：CN112877275B
公开(公告)日：2023-03-31
申请号：CN202110154125.X
申请日：2021-02-04
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要： 本发明公开了HDAC2基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC2进行基因敲除；发明人将用于敲除HDAC2的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆；提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了1个HDAC2基因发生纯合移码突变的细胞克隆；其中HDAC2‑KO‑B3在Cas9预定切割位置处有1个碱基的缺失。HDAC2敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC2敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC2，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。
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