公开(公告)号：CN113249456A

公开(公告)日：2021-08-13

申请号：CN202110557343.8

申请日：2021-05-21

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  赵红业 ,  赵恒 ,  角德灵 ,  范柠粼

IPC分类号： C12Q1/6869 ,  C12Q1/06

摘要： 本发明涉及一种快速筛选基因编辑猪阳性细胞系的方法，属动物转基因技术领域。本发明针对已知的不同基因编辑类型的猪阳性成纤维细胞系，进行PCR、酶切及测序鉴定，基于细胞PCR条带灰度值，筛选获得细胞基因型鉴定所需的最低细胞量；将目的基因表达载体转染至猪成纤维细胞并进行单细胞培养筛选，当单克隆细胞系形成时，抠取后于培养板扩大培养并按上述最低细胞量计数进行基因型鉴定，经鉴定后立即进行体细胞核移植，取出胎儿分离培养及鉴定后获得大量转基因猪阳性成纤维细胞系。本发明克服了基因编辑猪阳性细胞系筛选周期长、效率低、成功率低的问题，对促进转基因猪的生产具有重要的意义。

公开(公告)号：CN108342491A

公开(公告)日：2018-07-31

申请号：CN201810362449.0

申请日：2018-04-20

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  赵红业 ,  角德灵 ,  李鸿辉 ,  赵恒

IPC分类号： C12Q1/6888

摘要： 本发明涉及一种筛选异种移植供体猪最佳基因组合的方法，属动物生物技术领域。以人成纤维细胞为研究对象，建立人成纤维细胞体外相容性评价方法，用此方法验证已报道的心脏或其他移植存活时间长的基因修饰猪成纤维细胞的结果，筛出更适合的补体调节因子、免疫应答因子及抗凝血因子，在GTKO的基础上，对上述因子组合后进行定点敲入或敲除，再对不同多因子组合的猪成纤维细胞用此方法进行早期筛选，获得3种以上最佳基因组合的细胞再克隆，克隆猪进行猪-非灵长类的心脏移植验证此筛选方法的可靠性。本发明不需在获得基因组合修饰猪的基础上即可评价最佳基因组合，将极大地节约基因组合筛选时间和经费投入，对开发真正的异种移植供体猪具有重大的意义。

公开(公告)号：CN116640804A

公开(公告)日：2023-08-25

申请号：CN202310428547.0

申请日：2023-04-20

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  角德灵 ,  郭建雄 ,  魏太云

IPC分类号： C12N15/877 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种基于体细胞核移植技术构建三倍体猪的方法。本发明在体外建立二倍体猪细胞系，以此为核供体进行体细胞核移植，经电融合、电激活后构建克隆胚，检测其克隆胚的体外发育潜力，进一步移植至代孕母猪中继续发育，适时根据B超监测结果获取胎儿，建立胎儿成纤维细胞系进行倍性鉴定及核型分析。以三倍体猪胎儿成纤维细胞为核供体再次体细胞核移植，经电融合、电激活后构建克隆胚，检测其克隆胚的体外发育能力，并进一步移植至代孕母猪体内，生产三倍体猪。本发明克服了猪三倍体胚胎发育效率低、成功率低的问题，对三倍体猪的生产及应用具有重要的意义。

公开(公告)号：CN116640803A

公开(公告)日：2023-08-25

申请号：CN202310428544.7

申请日：2023-04-20

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  角德灵 ,  郭建雄 ,  魏太云

IPC分类号： C12N15/877 ,  C12N5/077 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种通过秋水仙素诱导多倍体猪的方法。本发明针对二倍体猪成纤维细胞系，利用不同浓度的秋水仙素诱导，通过检测不同浓度诱导后的细胞倍性变化，筛选最佳的秋水仙素浓度，进一步诱导生产多倍体猪细胞系，以此为体细胞核移植的核供体构建猪多倍体克隆胚，再进行胚胎移植生产四倍体猪。本发明首次将秋水仙素成功应用于猪多倍体的诱导中，对促进多倍体猪的生产及育种应用研究具有重要的意义。

公开(公告)号：CN110373389A

公开(公告)日：2019-10-25

申请号：CN201910497785.0

申请日：2019-06-10

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  郭建雄 ,  卿玉波 ,  贾宝瑜 ,  成文敏 ,  角德灵

IPC分类号： C12N5/10 ,  C12N15/877 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种适合胰岛细胞及皮肤等组织异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建上述六基因修饰的异种移植供体的基础猪，在此基础猪上再敲除B2M基因，同时定点插入hCD47、A20、CTLA4-Ig三个基因，再利用体细胞核移植技术构建多基因修饰的胰岛细胞及皮肤异种移植供体猪，再对该供体猪进行功能验证，获得适合胰岛细胞及皮肤异种移植供体猪。本发明为异种胰岛细胞及皮肤等移植供体猪的开发提供了全新的研究思路和方法，促进了猪作为异种胰岛细胞及皮肤移植的临床转化和应用。

公开(公告)号：CN106755112B

公开(公告)日：2019-07-12

申请号：CN201611224097.X

申请日：2016-12-27

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  王文 ,  卿玉波 ,  赵红业 ,  角德灵

IPC分类号： C12N15/877 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法。利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种，通过从家畜群体中筛选出经济性状优良的个体，建立成纤维细胞系，利用体细胞核移植技术对上述筛选出的个体进行克隆，待克隆出生的个体达到适配年龄后，进行组合杂交，再对每一杂交组合的F1代个体的经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后对相应的父母个体进行淘汰，对留下的后代个体中可以稳定遗传的父母再进行组群，选育出优良家畜品种。通过对本发明的实施，能批量地获得具有极其优良经济性状的家畜个体，实现家畜特有品种资源的可持续开发利用，提高家畜的育种效率和选育的成功率。

公开(公告)号：CN110373392A

公开(公告)日：2019-10-25

申请号：CN201910498532.5

申请日：2019-06-10

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  赵恒 ,  赵红业 ,  角德灵 ,  徐凯祥 ,  郭建雄

IPC分类号： C12N5/10 ,  C12N15/877 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，在此基础猪上再定点插入hCD39、hTBM、REN三个修饰基因，构建多基因修饰的肾脏异种移植供体猪，再对该供体猪进行功能验证，获得适合肾脏异种移植的供体猪。本发明为适合异种肾脏移植供体猪的开发提供了科学的理论基础，为肾脏衰竭患者的移植治疗提供了希望。

公开(公告)号：CN110373391A

公开(公告)日：2019-10-25

申请号：CN201910498531.0

申请日：2019-06-10

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  角德灵 ,  赵红业 ,  赵恒 ,  徐凯祥 ,  李鸿辉

IPC分类号： C12N5/10 ,  C12N15/877 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因后并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，再在此基础猪的Rosa26位点再定点插入hCD39、hTBM两个心脏功能修饰特异基因，构建出多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪再进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。本发明为异种心脏移植提供了可靠的供体猪，为处于终末期的心脏病患者的治疗提供了希望。

公开(公告)号：CN110358766A

公开(公告)日：2019-10-22

申请号：CN201910497797.3

申请日：2019-06-10

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  赵恒 ,  李鸿辉 ,  角德灵 ,  赵红业

IPC分类号： C12N15/113 ,  C12N15/90 ,  C12N15/867 ,  C12N15/65

摘要： 本发明涉及一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，属动物基因编辑技术领域。基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，针对猪基因组范围内的全部基因各设计1-2条靶向sgRNA，构建sgRNA慢病毒载体随机敲除文库并转染至HEK293T细胞中，收集病毒再转染至猪PK15细胞中，将转入病毒的猪PK15细胞包被到灵长类的胸腺或肾包膜下，或用人血清进行体外培养，分别在不同的时间内回收存活的细胞，再对回收的活细胞建立单细胞DNA文库或进行单细胞培养扩增后提取DNA，再用慢病毒载体上的通用引物扩增含有sgRNA的上述DNA片段，对敲除的单细胞基因位点进行定型，最终确定并查找出相关基因的信息。本发明的实施对猪作为异种器官移植过程中猪细胞表面新抗原的挖掘具有重要的指导意义。

公开(公告)号：CN110295194A

公开(公告)日：2019-10-01

申请号：CN201910497796.9

申请日：2019-06-10

申请人： 云南农业大学

发明人： 魏红江 ,  徐凯祥 ,  赵红业 ,  角德灵 ,  郭建雄 ,  赵恒 ,  李鸿辉 ,  卿玉波

IPC分类号： C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

摘要： 本发明涉及一种猪内源性逆转录病毒失活克隆猪的构建方法，属动物生物技术领域。通过ddPCR和全基因组测序比对，确定猪内源性逆转录病毒在猪胎儿成纤维细胞基因组中的拷贝数和其占据染色体的位置，利用CRISPR/Cas9技术构建猪内源性逆转录病毒失活载体转染至猪胎儿成纤维细胞，筛选获得的阳性细胞进行体细胞核移植，待妊娠时取出胎儿鉴定其失活与否，利用ddPCR和全基因组测序比对后，再对该猪胎儿成纤维细胞进行基因打靶，依次循环，直至获得猪内源性逆转录病毒完全失活的细胞后进行体细胞核移植，最终获得猪内源性逆转录病毒完全失活的克隆猪。本发明克服了猪内源性逆转录病毒失活效率低、成功率低的问题，对解决异种器官移植的安全性问题具有重要的意义。