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公开(公告)号：CN117987465A
公开(公告)日：2024-05-07
申请号：CN202410034211.0
申请日：2024-01-10
申请人： 云南农业大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/113 , C12N15/12 , C12N5/10 , C12N9/22 , C12N15/877 , C12N15/90 , C12R1/91
摘要： 本发明涉及一种十基因编辑异种器官移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在野生型猪胎儿成纤维细胞系中，敲除GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因，转入hCD39、hCD46、hCD47、hCD55、hCD59、hTBM、hEPCR人源化基因，构建GTKO/β4GalNT2KO/CMAHKO/hCD39/hCD46/hCD47/hCD55/hCD59/hTBM/hEPCR十基因编辑克隆猪，进一步对克隆猪基因型鉴定、mRNA和蛋白表达分析，获得十基因编辑异种器官移植供体猪。本发明通过对猪抗原基因敲除并转入人源化基因进行组合修饰，解决了异种器官移植过程中面临的超急性免疫排斥反应、抗原‑抗体介导的免疫排斥反应、受体免疫细胞活化及凝血障碍等问题，克服了现有克隆猪生产率低、存活率低及基因编辑成功率低等障碍，对促进猪‑非人灵长类异种器官移植临床前研究和猪‑人异种器官移植临床化应用具有重要的应用价值。
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公开(公告)号：CN116640804A
公开(公告)日：2023-08-25
申请号：CN202310428547.0
申请日：2023-04-20
申请人： 云南农业大学
IPC分类号： C12N15/877 , A01K67/027
摘要： 本发明涉及一种基于体细胞核移植技术构建三倍体猪的方法。本发明在体外建立二倍体猪细胞系，以此为核供体进行体细胞核移植，经电融合、电激活后构建克隆胚，检测其克隆胚的体外发育潜力，进一步移植至代孕母猪中继续发育，适时根据B超监测结果获取胎儿，建立胎儿成纤维细胞系进行倍性鉴定及核型分析。以三倍体猪胎儿成纤维细胞为核供体再次体细胞核移植，经电融合、电激活后构建克隆胚，检测其克隆胚的体外发育能力，并进一步移植至代孕母猪体内，生产三倍体猪。本发明克服了猪三倍体胚胎发育效率低、成功率低的问题，对三倍体猪的生产及应用具有重要的意义。
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公开(公告)号：CN116640803A
公开(公告)日：2023-08-25
申请号：CN202310428544.7
申请日：2023-04-20
申请人： 云南农业大学
IPC分类号： C12N15/877 , C12N5/077 , A01K67/027
摘要： 本发明涉及一种通过秋水仙素诱导多倍体猪的方法。本发明针对二倍体猪成纤维细胞系，利用不同浓度的秋水仙素诱导，通过检测不同浓度诱导后的细胞倍性变化，筛选最佳的秋水仙素浓度，进一步诱导生产多倍体猪细胞系，以此为体细胞核移植的核供体构建猪多倍体克隆胚，再进行胚胎移植生产四倍体猪。本发明首次将秋水仙素成功应用于猪多倍体的诱导中，对促进多倍体猪的生产及育种应用研究具有重要的意义。
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公开(公告)号：CN110373389A
公开(公告)日：2019-10-25
申请号：CN201910497785.0
申请日：2019-06-10
申请人： 云南农业大学
IPC分类号： C12N5/10 , C12N15/877 , A01K67/027
摘要： 本发明涉及一种适合胰岛细胞及皮肤等组织异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建上述六基因修饰的异种移植供体的基础猪，在此基础猪上再敲除B2M基因，同时定点插入hCD47、A20、CTLA4-Ig三个基因，再利用体细胞核移植技术构建多基因修饰的胰岛细胞及皮肤异种移植供体猪，再对该供体猪进行功能验证，获得适合胰岛细胞及皮肤异种移植供体猪。本发明为异种胰岛细胞及皮肤等移植供体猪的开发提供了全新的研究思路和方法，促进了猪作为异种胰岛细胞及皮肤移植的临床转化和应用。
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公开(公告)号：CN110373392A
公开(公告)日：2019-10-25
申请号：CN201910498532.5
申请日：2019-06-10
申请人： 云南农业大学
IPC分类号： C12N5/10 , C12N15/877 , A01K67/027
摘要： 本发明涉及一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，在此基础猪上再定点插入hCD39、hTBM、REN三个修饰基因，构建多基因修饰的肾脏异种移植供体猪，再对该供体猪进行功能验证，获得适合肾脏异种移植的供体猪。本发明为适合异种肾脏移植供体猪的开发提供了科学的理论基础，为肾脏衰竭患者的移植治疗提供了希望。
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公开(公告)号：CN110295194A
公开(公告)日：2019-10-01
申请号：CN201910497796.9
申请日：2019-06-10
申请人： 云南农业大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/90 , C12N5/10 , A01K67/027
摘要： 本发明涉及一种猪内源性逆转录病毒失活克隆猪的构建方法，属动物生物技术领域。通过ddPCR和全基因组测序比对，确定猪内源性逆转录病毒在猪胎儿成纤维细胞基因组中的拷贝数和其占据染色体的位置，利用CRISPR/Cas9技术构建猪内源性逆转录病毒失活载体转染至猪胎儿成纤维细胞，筛选获得的阳性细胞进行体细胞核移植，待妊娠时取出胎儿鉴定其失活与否，利用ddPCR和全基因组测序比对后，再对该猪胎儿成纤维细胞进行基因打靶，依次循环，直至获得猪内源性逆转录病毒完全失活的细胞后进行体细胞核移植，最终获得猪内源性逆转录病毒完全失活的克隆猪。本发明克服了猪内源性逆转录病毒失活效率低、成功率低的问题，对解决异种器官移植的安全性问题具有重要的意义。
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