公开(公告)号：CN116926105A

公开(公告)日：2023-10-24

申请号：CN202211408928.4

申请日：2022-11-10

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 柳李旺 ,  应佳丽 ,  王燕 ,  徐良 ,  王爽 ,  谢洋 ,  沈峰

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/65 ,  A01H5/00 ,  A01H6/20

Abstract: 本发明公开了一种发根农杆菌介导的萝卜功能基因编辑方法及其应用，首次在‘NAU‑LHZ’萝卜中通过发根农杆菌介导的遗传转化实现萝卜功能基因编辑。发根农杆菌侵染无根幼苗后，在MS固体培养基上共培养3d后，置于MS+300mg/L Carb的固体培养基上培养不定根。以RsGLK2.1基因为例，1株发根农杆菌诱导的不定根在靶位点2中成功被编辑，将成功编辑的不定根置于MS+0.75mg/L TDZ+0.35mg/L NAA+300mg/L Carb的固体培养基中诱导愈伤组织，通过愈伤组织表型分析进一步证实其成功编辑。本发明可快速验证萝卜关键候选基因的生物学功能，极大地加快萝卜优异种质创新与新品种选育进程。

公开(公告)号：CN117384946A

公开(公告)日：2024-01-12

申请号：CN202211408927.X

申请日：2022-11-10

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 柳李旺 ,  应佳丽 ,  王燕 ,  徐良 ,  姚数琦 ,  谢洋 ,  沈峰 ,  王爽

IPC: C12N15/84 ,  A01H5/00 ,  A01H6/20

Abstract: 本发明公开了一种根癌农杆菌介导的萝卜遗传转化方法及其应用，选取4～5d苗龄的萝卜‘NAU‑LHZ’带柄子叶为外植体，预培养3d后，用1/2MS液体培养基重悬农杆菌作为侵染液，将外植体于28℃ 200rpm摇床中振荡培养20min，放滤纸上晾干，在黑暗下共培养3d后转到脱羧培养基上分化培养，直至生根培养获得萝卜再生植株。提取萝卜叶片DNA，使用通用引物鉴定是否导入目的基因。同时采用RT‑qPCR验证目的基因是否过表达。此外，将电泳鉴定的萝卜转基因阳性苗自交，获得T2代株系后提取DNA，采用通用引物扩增鉴定萝卜转基因阳性苗，T2代株系转化效率达46.15％。与前人已报道的浸花法相比，本发明提高了转化和筛选效率，为萝卜高效转化和基因功能验证提供了新方法，也为萝卜等再生顽拗型作物的转基因研究提供了技术支撑。

公开(公告)号：CN113444161A

公开(公告)日：2021-09-28

申请号：CN202110730694.4

申请日：2021-06-29

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 柳李旺 ,  沈峰 ,  徐良 ,  王燕 ,  应佳丽 ,  何晴

IPC: C07K14/415 ,  C12N15/29 ,  C12N15/82 ,  A01H5/00 ,  A01H6/20

Abstract: 本发明公开了一种萝卜膜联蛋白RsANN1a及其编码基因和应用，包括：(1)萝卜膜联蛋白RsANN1a核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；(2)以萝卜cDNA为模板对RsANN1a进行克隆；(3)RsANN1a基因在高温胁迫下表达特性分析，结果显示RsANN1a基因能够响应高温胁迫，并且在高温处理下其表达量显著上升；(4)本发明还对RsANN1a基因的功能进行鉴定，在野生型拟南芥中过表达RsANN1a能够显著提高其耐热能力。本发明为今后利用基因工程技术培育耐高温萝卜提供了理论依据，具有很高的应用价值。

公开(公告)号：CN116926106A

公开(公告)日：2023-10-24

申请号：CN202211523455.2

申请日：2022-11-30

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 柳李旺 ,  应佳丽 ,  王燕 ,  徐良 ,  马银波 ,  王沦 ,  姚数琦

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/84 ,  C12N15/53 ,  A01H5/00 ,  A01H6/20

Abstract: 本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9系统的萝卜基因编辑技术及其应用，首次在萝卜‘NAU‑067’中通过根癌农杆菌介导的遗传转化实现萝卜RsPDS基因编辑。将培养4～5d无菌苗切取带柄子叶后置于MS固体培养基上预培养3d，根癌农杆菌侵染萝卜带柄子叶后在MS固体培养基上共培养3d，之后置于MS+0.75mg/L TDZ+0.35mg/L NAA+300mg/L Carb的固体培养基上诱导不定芽。以RsPDS基因为例，出芽后采用GUS染色初步分析是否为转基因阳性愈伤组织，采用改良CTAB法提取白化苗DNA，PCR扩增发现1株新叶全白化苗在靶位点2存在3个碱基缺失和单个碱基替换，1株白化嵌合株在靶位点1存在3个碱基插入和单个碱基替换。本发明建立起一种基于CRISPR/Cas9系统的萝卜功能基因编辑技术体系，为创制突变体、高效验证基因的生物学功能以及创制萝卜优异种质提供了重要技术支撑。

公开(公告)号：CN114958904B

公开(公告)日：2023-10-24

申请号：CN202210536365.0

申请日：2022-05-20

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 王燕 ,  王爽 ,  易小芳 ,  应佳丽 ,  董俊辉 ,  柳李旺 ,  徐良

IPC: C12N15/82 ,  A01H5/06 ,  A01H6/20 ,  C12N15/10

Abstract: 本发明涉及一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括：对萝卜种子进行消毒种植无菌苗；活化携带目的基因的发根农杆菌；制备侵染液；获取无根苗外植体并浸入菌液进行侵染；经过共培养和脱菌培养30d后，通过表型筛选、PCR检测和qRT‑PCR分析鉴定阳性毛状根；切取阳性毛状根放置于愈伤组织培养基上诱导愈伤组织，获得转基因愈伤组织。本发明提高了发根农杆菌诱导萝卜毛状根的效率，缩短了发根时间，成功诱导了转基因愈伤组织，能够进行萝卜部分本体基因功能验证。

公开(公告)号：CN114958904A

公开(公告)日：2022-08-30

申请号：CN202210536365.0

申请日：2022-05-20

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 王燕 ,  王爽 ,  易小芳 ,  应佳丽 ,  董俊辉 ,  柳李旺 ,  徐良

IPC: C12N15/82 ,  A01H5/06 ,  A01H6/20 ,  C12N15/10

Abstract: 本发明涉及一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括：对萝卜种子进行消毒种植无菌苗；活化携带目的基因的发根农杆菌；制备侵染液；获取无根苗外植体并浸入菌液进行侵染；经过共培养和脱菌培养30d后，通过表型筛选、PCR检测和qRT‑PCR分析鉴定阳性毛状根；切取阳性毛状根放置于愈伤组织培养基上诱导愈伤组织，获得转基因愈伤组织。本发明提高了发根农杆菌诱导萝卜毛状根的效率，缩短了发根时间，成功诱导了转基因愈伤组织，能够进行萝卜部分本体基因功能验证。

公开(公告)号：CN111088260A

公开(公告)日：2020-05-01

申请号：CN202010046089.0

申请日：2020-01-16

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 王燕 ,  应佳丽 ,  柳李旺 ,  张旸 ,  徐良

IPC: C12N15/29 ,  C07K14/415 ,  C12N15/10 ,  C12N15/82 ,  A01H5/00 ,  A01H6/20

Abstract: 本发明属于植物生物技术与分子育种领域，涉及萝卜盐胁迫响应过程中显著变化基因RsNHX1，具体涉及萝卜耐盐基因RsNHX1及应用，萝卜耐盐基因RsNHX1的核苷酸序列如SEQ ID N O.1所示，含有所述的耐盐基因RsNHX1的转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明填补萝卜耐盐基因RsNHX1的空白，提供萝卜耐盐基因RsNHX1的cDNA序列，采用RT-qPCR技术分析盐胁迫下不同时间RsNHX1基因的表达特性，进一步设计克隆引物构建pCAMBIA2301-RsNHX1过表达载体和抑制表达载体，转化拟南芥后kan+筛选，以及盐处理表型鉴定。