公开(公告)号：CN102367432B

公开(公告)日：2014-10-15

申请号：CN201110289796.3

申请日：2011-09-28

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  田灵芝

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/60 ,  C12N15/63 ,  C12P13/00 ,  C12R1/19

Abstract: 一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产GABA上的应用。首先，PCR扩增获得植物乳杆菌GB 01-21谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，构建了重组质粒pET-28a-lpgad，并在E.coli BL21(DE3)成功表达，其次，粗酶液采用Ni柱亲和层析纯化获得重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究，用于指导转化条件的优化。最终5L发酵罐上进行转化实验，GABA累积浓度可达204.5g/L，摩尔转化率为97.92％，为进一步工业化应用打下了良好的基础。

公开(公告)号：CN112852701A

公开(公告)日：2021-05-28

申请号：CN202110171925.2

申请日：2021-02-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  田灵芝 ,  徐美娟 ,  杨套伟 ,  张显

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/60 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12P7/42 ,  C12P7/40 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种合成(S)‑2‑羟基丁酸的单细胞工厂的构建与应用，属于生物技术领域。本发明将L‑苏氨酸脱氨酶、L‑乳酸脱氢酶及脱氢酶基因串联表达构建重组的大肠杆菌单细胞工厂用于(S)‑2‑羟基丁酸高效合成，通过RBS序列优化控制L‑苏氨酸脱氨酶的表达量，解决中间产物酮丁酸的快速积累而抑制转化的问题。利用单细胞工厂进行全细胞转化可减少物质进出障碍加快转化速率，促进辅因子胞内循环而无需外源添加，成本低廉。采用本发明构建的方法制备的(S)‑2‑羟基丁酸的产量达到136g/L，(S)‑2‑羟基丁酸的时空产率为8.5g/L·h；并且副产物丙酮很容易通过蒸馏去除，为其工业化生产提供实际有效策略。

公开(公告)号：CN112813043A

公开(公告)日：2021-05-18

申请号：CN202110217977.9

申请日：2021-02-23

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  田灵芝 ,  徐美娟 ,  杨套伟 ,  张显

IPC: C12N9/04 ,  C12N15/53 ,  C12N15/70 ,  C12N15/75 ,  C12N1/21 ,  C12P7/42 ,  C12R1/19 ,  C12R1/125

Abstract: 本发明公开了一种酶活及稳定性提高的L‑乳酸脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。此突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的L‑乳酸脱氢酶的第184位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸得到的；其比酶活可达563.3±6.5U/mg、Kcat/Km可达268.2±19.5mM‑1·S‑1，分别较野生型提高了1.15倍、2.73倍以2‑酮丁酸为底物，具有辅酶再生的(S)‑2‑羟基丁酸的不对称催化合成揭示了突变体在12小时内的产量为95.8g/L，与野生型相比提高1.05倍，因此本发明的L‑乳酸脱氢酶突变体更适合(S)‑2‑羟基丁酸生产。

公开(公告)号：CN102367432A

公开(公告)日：2012-03-07

申请号：CN201110289796.3

申请日：2011-09-28

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  田灵芝

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/60 ,  C12N15/63 ,  C12P13/00 ,  C12R1/19

Abstract: 一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产GABA上的应用。首先，PCR扩增获得植物乳杆菌GB 01-21谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，构建了重组质粒pET-28a-lpgad，并在E.coli BL21(DE3)成功表达，其次，粗酶液采用Ni柱亲和层析纯化获得重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究，用于指导转化条件的优化。最终5L发酵罐上进行转化实验，GABA累积浓度可达204.5g/L，摩尔转化率为97.92％，为进一步工业化应用打下了良好的基础。

公开(公告)号：CN101864441A

公开(公告)日：2010-10-20

申请号：CN201010176347.3

申请日：2010-05-19

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  韩冷 ,  田灵芝 ,  夏海锋

IPC: C12N15/63 ,  C12N1/21 ,  C12R1/32

Abstract: 一种敲除分枝杆菌ksdD基因的方法及其应用，属于生物工程中分子生物学领域。分枝杆菌(Mycobacterium)能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮(AD)和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮(ADD)，其中由ksdD基因编码的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KSDD)是AD转化为ADD的关键酶。本发明以本实验室保藏的一株分枝杆菌为出发菌株，首先扩增出长度约1.7kb编码KSDD的ksdD基因全序列，在基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km)，将得到的基因元件ksdD::Km电转化分枝杆菌，通过PCR验证获得稳定遗传的ksdD基因缺失重组转化子。经检测转化子的比酶活为15.6mu/mg，而原始菌株比酶活为105.4mu/mg，转化子与原始菌株相比，其KSDD酶活性下降了85％。在研究转化子对甾醇的转化情况时，以原始菌株作为对照。两者相比较，转化子AD产量提高了1倍，而ADD产量下降了35.2％。