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    Erzeugung von schwach aktiven oder inaktiven Mutanten von Alkalischer Phosphatase und deren Expression in Hefe
    3.
    发明公开
    Erzeugung von schwach aktiven oder inaktiven Mutanten von Alkalischer Phosphatase und deren Expression in Hefe 有权
    碱性磷酸酶的弱活性或无活性的突变体的产生和其在酵母中的表达

    公开(公告)号：EP1348760A2

    公开(公告)日：2003-10-01

    申请号：EP03006426.5

    申请日：2003-03-21

    申请人： Roche Diagnostics GmbH ,  F.HOFFMANN-LA ROCHE AG

    发明人： Mueller, Rainer, Dr. ,  Thalhofer, Johann-Peter, Dr. ,  Geipel, Frank, Dr. ,  Hoelke, Werner, Dr. ,  Kirschbaum, Thomas, Dr.

    IPC分类号： C12N9/16 ,  C12N5/10

    CPC分类号： C12N9/16

    摘要： Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung bzw. Expression von eukaryontischen Alkalischen Phosphatase-Mutanten in Hefezellen, wobei die gezielt eingeführten Mutationen eine Reduktion der spezifischen AP-Aktivität um mindestens den Faktor 1:100 bewirken. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Insertion entsprechender Nukleinsäuresequenzen in einen Vektor zur Expression in methylotrophen Hefe-Stämmen sowie entsprechende Vektoren und Wirtsstämme.

    摘要翻译： 突变体的真核碱性磷酸酶（AP）的（I），其中与野生型序列至少77％同源的完全定义的487氨基酸序列（S2），并且其中AP活性至少100倍的降低，相对于 野生型，是新的。 突变体的真核碱性磷酸酶（AP）的（I），其中与野生型序列至少77％同源的完全定义的487氨基酸序列（S2），并且其中AP活性至少100倍的降低，相对于 野生型，是新的。 （I）含有以下突变（相对于序列（S2））中的至少一个：Asp42，316或357取代Asn，缬氨酸，丙氨酸或Ser; Ser92或155为丙氨酸，甘氨酸，缬氨酸或Leu; Glu311的Gln，天冬酰胺，亮氨酸，异亮氨酸或Met; His320，358或432天冬酰胺，苯丙氨酸，天冬氨酸或酪氨酸; 。Gly322或氨基酸为大于天冬氨酸独立权利要求中包含的，因此对以下几点：（1）重组DNA（II）没有编码（I），特别是4个完全定义的序列（IIA）; （2）含有载体（IIA）; （3）用所述载体转化的宿主细胞; 和（4）生产式（I）通过重组方法。

    Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe
    10.
    发明公开
    Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe 有权
    表达von Alkalischer磷酸酶在Hefe

    公开(公告)号：EP1176205A2

    公开(公告)日：2002-01-30

    申请号：EP01117822.5

    申请日：2001-07-21

    申请人： Roche Diagnostics GmbH ,  F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

    发明人： Mueller, Rainer, Dr. ,  Thalhofer, Johann-Peter, Dr. ,  Geipel, Frank, Dr. ,  Hoelke, Werner, Dr. ,  Glaser, Stephan, Dr. ,  Eckstein, Hellmut ,  Kirschbaum, Thomas, Dr. ,  Bommarius, Bettina, Dr.

    IPC分类号： C12N15/81 ,  C12N15/69 ,  C12N15/55 ,  C12N1/19

    CPC分类号： C12N9/16 ,  C12N15/815 ,  C12Y301/03001

    摘要： Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung bzw. Expression von eukaryontischer Alkalischer Phosphatase in Hefezellen, wobei insbesondere eine DNA, kodierend für eine eukaryontische hochaktive Alkalische Phosphatase mit einer spezifischen Aktivität über 3000 U/mg eingesetzt wird. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Insertion entsprechender Nukleinsäuresequenzen in einen Vektor zur Expression in methylotrophen Hefe-Stämmen sowie entsprechende Vektoren und Wirtsstämme.

    摘要翻译： 在酵母细胞中制备真核碱性磷酸酶（AP），包括将基因序列（A）克隆到不同载体中，转化和表达和纯化AP，是新的。 在酵母细胞中制备真核碱性磷酸酶（AP），包括将基因序列（A）克隆到不同载体中，转化和表达和纯化AP，是新的。 使用含有针对选择标记（SM1）的抗性基因（RG1）的第一载体，并且通过在含有低浓度SM1的培养基上生长选择将RG1和（A）整合到基因组中的转化体。 通过多重转化增加基因拷贝数，并在高选择压力下在生长培养基上选择多个转化体。 引入含有针对第二标记（SM2）的（A）和抗性基因（RG2）的第二载体，其拷贝数增加为RG1，并且选择具有多个拷贝（A）的克隆和RG1和RG2的拷贝， 整合到基因组中。 还包括以下独立权利要求：（1）说明书中完全定义的1476个碱基对序列（S5）; （2）载体（S5）; 和（3）用（2）的载体转化的宿主细胞。