公开(公告)号：US08669074B2

公开(公告)日：2014-03-11

申请号：US10857622

申请日：2004-05-28

申请人： Jonathan D. Violin ,  Alexandra C. Newton ,  Roger Y. Tsien ,  Jin Zhang

发明人： Jonathan D. Violin ,  Alexandra C. Newton ,  Roger Y. Tsien ,  Jin Zhang

IPC分类号： C12P21/04

CPC分类号： C12N9/1205 ,  C07K14/43595 ,  C07K2319/00 ,  C07K2319/60 ,  C12Q1/37 ,  C12Q1/42 ,  C12Q1/485 ,  G01N33/542 ,  G01N2333/43595

摘要： A chimeric phosphorylation indicator (CPI) as provided herein can contain a donor molecule, a phosphorylatable domain, a phosphoaminoacid binding domain (PAABD), and an acceptor molecule. Where the phosphorylatable domain is phosphorylatable by protein kinase C (PKC), the CPI is a c-kinase activity reporter (CKAR). Donor and acceptor molecules may be, independently, fluorescent proteins such as non-oligomerizing fluorescent proteins. A CPI can contain a phosphorylatable polypeptide and a fluorescent protein; the phosphorylatable polypeptide may be contained within the sequence of the fluorescent protein, or the fluorescent protein may be contained within the sequence of the phosphorylatable polypeptide. The spatiotemporal properties of the PKC signal pathway may be tested with CKAR, calcium-sensing fluorophores and FRET-based translocation assays. Polynucleotides encoding such CPIs, and kits containing the indicators and/or the polynucleotides, are provided. A method of using the chimeric phosphorylation indicators to detect a kinase or phosphatase in a sample is provided.

摘要翻译： 本文提供的嵌合磷酸化指示剂（CPI）可以含有供体分子，可磷酸化结构域，磷酸氨基酸结合结构域（PAABD）和受体分子。 当可磷酸化结构域由蛋白激酶C（PKC）磷酸化时，CPI是c-激酶活性报告物（CKAR）。 供体和受体分子可以独立地是荧光蛋白，例如非低聚荧光蛋白。 CPI可以含有可磷酸化的多肽和荧光蛋白; 可磷酸化多肽可以包含在荧光蛋白的序列内，或者荧光蛋白可以包含在可磷酸化多肽的序列内。 可以用CKAR，钙感应荧光团和基于FRET的易位测定来测试PKC信号通路的时空性质。 提供了编码这种CPI的多核苷酸，以及含有指示剂和/或多核苷酸的试剂盒。 提供了使用嵌合磷酸化指示剂来检测样品中的激酶或磷酸酶的方法。