公开(公告)号：CN111206044A

公开(公告)日：2020-05-29

申请号：CN202010138584.4

申请日：2020-03-03

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  王德华 ,  王磊 ,  程锐 ,  曾为俊 ,  马翔

IPC分类号： C12N15/66

摘要： 本发明公开了一种新的质粒载体构建方法。本发明首先公开了利用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法；进一步公开了包括crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白的成套试剂。本发明利用crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白替代限制性内切酶对载体进行线性化，得到线性化载体；运用PCR方法得到两端含同源臂的插入片段，该两端同源臂分别与所述线性化载体两端序列同源；运用同源重组克隆的方法将插入片段重组到线性化载体上，最终构建得到新的载体，整个构建过程中未使用任何限制性内切酶及连接酶，构建方法方便、灵活、通用、简单、高效。

公开(公告)号：CN114958759B

公开(公告)日：2024-05-07

申请号：CN202110200499.0

申请日：2021-02-23

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  陶裴裴 ,  刘瑜 ,  曾为俊 ,  王磊 ,  程锐 ,  黄彩云 ,  赵泽英 ,  马翔 ,  段星 ,  刘璐

IPC分类号： C12N5/10 ,  C12N15/12 ,  C12N15/85 ,  A01K67/0278

摘要： 本发明提供了一种表达人FUS蛋白的猪细胞和由该猪细胞通过体细胞克隆技术获得的肌萎缩侧索硬化症模型猪及其构建方法和在生物医药领域的应用。其中，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞和肌萎缩侧索硬化症模型猪，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。本申请研究对象应用性好，猪细胞中目的基因的表达量高、基因编辑效率高。

公开(公告)号：CN114958761B

公开(公告)日：2024-04-05

申请号：CN202110210421.7

申请日：2021-02-25

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  陶裴裴 ,  曾为俊 ,  王磊 ,  程锐 ,  黄彩云 ,  赵泽英 ,  马翔 ,  段星 ,  刘璐

IPC分类号： C12N5/10 ,  C12N15/12 ,  C12N15/53 ,  C12N15/61 ,  C12N15/113 ,  C12N15/55 ,  C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  A01K67/0278 ,  A61K49/00

摘要： 本发明提供了一种表达人WNT1、COX‑2和/或mPGES的猪细胞和由该猪细胞通过体细胞克隆技术获得的胃癌模型猪及其构建方法和在生物医药领域的应用。其中，包括将编码人WNT1、COX‑2和/或mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的WNT1、SEQ ID NO：15所示的COX‑2和/或SEQ ID NO：16所示的mPGES的猪细胞和胃癌模型猪，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。本申请研究对象应用性好，猪细胞中目的基因的表达量高、基因编辑效率高。

公开(公告)号：CN112522309B

公开(公告)日：2023-10-13

申请号：CN202010919735.X

申请日：2020-09-04

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  马翔 ,  曾为俊 ,  王磊 ,  程锐 ,  赵泽英

IPC分类号： C12N15/85 ,  C12N15/113 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

摘要： 本发明公开了重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法。具体来说，本发明涉及IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因这三个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞，以及用于制备该重组细胞的方法，以及用于制备该重组细胞的试剂盒。本发明提供了sgRNA组合，由sgRNAIL2RG‑g7、sgRNARAG1‑g4和sgRNARAG2‑g2组成。sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：24中第1‑20位核苷酸所示。sgRNARAG1‑g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：9中第1‑20位核苷酸所示。sgRNARAG2‑g2的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1‑20位核苷酸所示。本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。

公开(公告)号：CN115161335B

公开(公告)日：2023-08-25

申请号：CN202110361873.5

申请日：2021-04-02

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  陶裴裴 ,  曾为俊 ,  刘瑜 ,  王磊 ,  程锐 ,  赵泽英 ,  马翔 ,  黄彩云 ,  段星 ,  刘璐

IPC分类号： C12N15/72 ,  C12N1/21 ,  C12N9/22 ,  C07K19/00 ,  C12N15/85 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了用于构建TARDBP基因突变的ALS模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。该基因编辑系统包含按照本发明所述方法制备的Cas9蛋白，针对TARDBP基因的gRNA以及含有TARDBP突变位点的单链Donor DNA。采用本发明构建并表达的Cas9高效蛋白联合体外转录的gRNA进行基因编辑，并对Cas9和gRNA的最佳用量配比进行了优化，配合合成的ssODN作为Donor DNA，最终获得靶标位点精确点突变的单细胞克隆比率高达22.5％，远高于常规的点突变效率(

公开(公告)号：CN116064661A

公开(公告)日：2023-05-05

申请号：CN202211011546.8

申请日：2022-08-23

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  马翔 ,  王磊 ,  程锐 ,  方园 ,  赵泽英 ,  胡世芳

IPC分类号： C12N15/85 ,  C12N15/113 ,  C12N15/877 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027 ,  C12Q1/02 ,  C12N15/70 ,  C12N15/12 ,  C12N9/22 ,  C07K19/00 ,  A61K49/00

摘要： 本发明公开了用于构建NF1基因突变的I型神经纤维瘤病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种制备重组细胞的方法：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合ssODN同源重组技术进行了NF1基因的的定向基因编辑，模拟I型神经纤维瘤病的自然发病遗传特征，并获得了NF1基因定向突变的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育I型神经纤维瘤病模型猪奠定了基础。

公开(公告)号：CN116064473A

公开(公告)日：2023-05-05

申请号：CN202210984913.6

申请日：2022-08-17

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  马翔 ,  王磊 ,  程锐 ,  方园 ,  赵泽英 ,  胡世芳

IPC分类号： C12N9/22 ,  C12N15/113 ,  C07K19/00 ,  C12N15/85 ,  C12N5/10 ,  C12N15/70 ,  C07K1/22 ,  C12N15/62 ,  A01K67/027 ,  C12Q1/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了用于构建ATM基因突变的共济失调‑毛细血管扩张症模型猪核移植供体细胞的试剂盒。本发明提供了包括SEQ ID NO：16所示ATM‑gRNA1、SEQ ID NO：17所示ATM‑gRNA4和NCN蛋白的试剂盒。本发明还提供了制备重组细胞的方法：将ATM‑gRNA1、ATM‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。所述重组细胞为ATM基因发生突变的重组细胞。试剂盒的用途为：制备重组细胞；制备共济失调‑毛细血管扩张症模型猪；制备共济失调‑毛细血管扩张症细胞模型或共济失调‑毛细血管扩张症组织模型或共济失调‑毛细血管扩张症器官模型。本发明对于共济失调‑毛细血管扩张症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

公开(公告)号：CN112522311B

公开(公告)日：2023-05-02

申请号：CN202011300411.4

申请日：2020-11-19

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  马翔 ,  刘璐 ,  曾为俊 ,  王磊 ,  程锐 ,  陶裴裴 ,  赵泽英 ,  黄彩云

IPC分类号： C12N15/85 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

摘要： 本发明公开了用于ADCY3基因编辑的CRISPR系统及其在构建肥胖症猪核移植供体细胞中应用。一种用于猪ADCY3基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪ADCY3基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.18所示。本发明针对猪ADCY3基因设计了四个gRNA，从中筛选高效gRNA后再进行预设靶点的敲除，可有效降低后期单克隆细胞鉴定筛选的工作量，并可直接用PCR产物测序来检测基因编辑效率。

公开(公告)号：CN112522292B

公开(公告)日：2023-05-02

申请号：CN202011178268.6

申请日：2020-10-29

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  陶裴裴 ,  曾为俊 ,  王磊 ,  程锐 ,  马翔 ,  赵泽英 ,  刘璐 ,  黄彩云

IPC分类号： C12N15/55 ,  C12N15/113 ,  C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  C12N15/65 ,  C12N5/10

摘要： 本发明公开了一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。猪RPE65基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.23所示。一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含本发明所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体。所述的Cas9表达载体为pU6gRNA eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。本发明为先天性黑蒙症猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于针对该病的治疗及病理研究具有重大应用价值。

公开(公告)号：CN115976018A

公开(公告)日：2023-04-18

申请号：CN202211030707.8

申请日：2022-08-26

申请人： 南京启真基因工程有限公司

发明人： 牛冬 ,  汪滔 ,  马翔 ,  王磊 ,  程锐 ,  方园 ,  赵泽英 ,  胡世芳

IPC分类号： C12N15/113 ,  C12N9/22 ,  C07K19/00 ,  C12N5/10 ,  C12N15/877 ,  C12N15/70 ,  A01K67/027 ,  A61K49/00 ,  C12Q1/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了构建ABCA12基因突变的斑色鱼鳞癣模型猪核移植供体细胞的试剂盒及其应用。本发明提供了包括SEQ ID NO：16所示ABCA12‑gRNA1、SEQ ID NO：17所示ABCA12‑gRNA4和NCN蛋白的试剂盒。本发明还提供了制备重组猪细胞的方法：将ABCA12‑gRNA1、ABCA12‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组猪细胞。所述重组猪细胞为ABCA12基因发生突变的重组猪细胞。试剂盒的用途为：制备重组猪细胞；制备斑色鱼鳞癣模型猪；制备斑色鱼鳞癣细胞模型或斑色鱼鳞癣组织模型或斑色鱼鳞癣器官模型。本发明对于斑色鱼鳞癣药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。