公开(公告)号：CN101219216A

公开(公告)日：2008-07-16

申请号：CN200810013673.5

申请日：2008-01-24

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 ,  青岛农业大学

发明人： 王金宝 ,  任慧英 ,  李俊 ,  张秀美 ,  温建新 ,  周顺 ,  李文立 ,  张乐萃 ,  宋春阳

IPC分类号： A61K39/295 ,  C12N15/34 ,  C12N15/40 ,  C12N15/85 ,  A61P31/12 ,  A61P15/00 ,  A61P11/00

摘要： 本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT－PCR方法分别扩增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒S－W－PIRES。将重组质粒转染COS1细胞，通过RT－PCR方法检测到PRRSV ORF3及ORF5基因的转录，通过免疫组化检测到目的蛋白的瞬间表达。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP3蛋白及GP5蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体及细胞免疫反应，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

公开(公告)号：CN101219216B

公开(公告)日：2012-10-17

申请号：CN200810013673.5

申请日：2008-01-24

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 ,  青岛农业大学

发明人： 王金宝 ,  任慧英 ,  李俊 ,  张秀美 ,  温建新 ,  周顺 ,  李文立 ,  张乐萃 ,  宋春阳

IPC分类号： A61K39/295 ,  C12N15/34 ,  C12N15/40 ,  C12N15/85 ,  A61P31/12 ,  A61P15/00 ,  A61P11/00

摘要： 本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒S-W-PIRES。将重组质粒转染COS1细胞，通过RT-PCR方法检测到PRRSV ORF3及ORF5基因的转录，通过免疫组化检测到目的蛋白的瞬间表达。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP3蛋白及GP5蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体及细胞免疫反应，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

公开(公告)号：CN101220397B

公开(公告)日：2012-07-04

申请号：CN200810014062.2

申请日：2008-01-23

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 王金宝 ,  任慧英 ,  李俊 ,  吴家强 ,  张秀美 ,  周顺 ,  温建新 ,  时建立 ,  刘玉庆

IPC分类号： C12Q1/70 ,  C12Q1/68

摘要： 本发明提供一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒。通过自行设计特异性引物PSX1/PSX2，提取病毒RNA并反转录为cDNA，利用PCR方法检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp。该专用试剂盒，与现有技术相比，具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IPMA方法相比符合率可达90％以上。该引物对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒的扩增结果均为阴性，能够区分NSP2变异株与传统株；该方法可检出12.8ng/L的PRRSV，可广泛用于临床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测。

公开(公告)号：CN101401936A

公开(公告)日：2009-04-08

申请号：CN200810014054.8

申请日：2008-01-23

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 王金宝 ,  李俊 ,  任慧英 ,  吴家强 ,  张秀美 ,  周顺 ,  温建新 ,  赵鸿雁

IPC分类号： A61K39/295 ,  C12N15/34 ,  C12N15/40 ,  C12N15/85 ,  A61P31/12 ,  A61P15/00 ,  A61P11/00

摘要： 本发明猪繁殖与综合症病毒和猪圆环病毒双价核酸疫苗的制备方法，简称共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法，本发明根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCSA MCSB多克隆位点的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD1株的ORF2基因阅读框架，同时考虑外源基因的表达量在基因起始密码子的前面加入Kozak序列，分别设计了针对ORF5、ORF2的引物Y1/Y2，H1/H2。将PCR产物ORF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES－ORF2，RT－PCR产物ORF5经双酶切回收后插入pIRES－ORF2构建成重组质粒pIRES－ORF2/ORF5。经PCR、RT－PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES－ORF2/ORF5。

公开(公告)号：CN101422608A

公开(公告)日：2009-05-06

申请号：CN200810014061.8

申请日：2008-01-23

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 王金宝 ,  温建新 ,  任慧英 ,  吴家强 ,  李俊 ,  张秀美 ,  周顺 ,  宋春阳

IPC分类号： A61K39/39 ,  A61K39/12 ,  C12N15/40 ,  C12N15/85 ,  A61P31/12

摘要： 本发明为一种含有CpG－ODN和表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的核酸疫苗的制备方法。该方法是通过构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG－pVAX1－ORF5，经酶切鉴定和序列测定，将重组质粒转染COS－7细胞，经间接免疫荧光试验证实CpG－pVAX1－ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠和猪，检测鼠和猪的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平。试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG－pVAX1－ORF5能诱导小鼠和猪产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。有效地提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果。

公开(公告)号：CN101401937A

公开(公告)日：2009-04-08

申请号：CN200810014058.6

申请日：2008-01-23

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 王金宝 ,  李俊 ,  任慧英 ,  吴家强 ,  张秀美 ,  温建新 ,  周顺 ,  徐绍建

IPC分类号： A61K39/295 ,  C12N15/34 ,  C12N15/40 ,  C12N15/85 ,  A61P31/12 ,  A61P15/00 ,  A61P11/00

摘要： 本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV) ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT－PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES－ORF5及ORF6，将重组质粒转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT－PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS－PAGE和Western blot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

公开(公告)号：CN101236205A

公开(公告)日：2008-08-06

申请号：CN200810014057.1

申请日：2008-01-23

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 王金宝 ,  张祯涛 ,  李俊 ,  任慧英 ,  吴家强 ,  张秀美 ,  丛晓燕 ,  温建新 ,  周顺

IPC分类号： G01N33/569

摘要： 本发明提供一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，该方法是针对PRRSV VR－2332株的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX－6P－1－N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的氨基酸序列，建立针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30－N，重组质粒在大肠杆菌中成功表达，利用表达纯化的北美洲型N蛋白，制备用于PRRS抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒，该抗体试剂盒与IDEXX试剂盒的符合率均可达到90％，以纯化的欧洲型蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法，为PRRS抗体分型检测打下基础。

公开(公告)号：CN101881770B

公开(公告)日：2013-07-10

申请号：CN200910014999.4

申请日：2009-05-08

申请人： 青岛农业大学 ,  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 ,  山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 周顺 ,  纪卫宁 ,  崔尚金 ,  李俊 ,  王金宝 ,  袁小远

IPC分类号： G01N33/569 ,  G01N33/558 ,  G01N33/532 ,  G01N33/552 ,  C12P19/34 ,  C12N15/70 ,  C12P21/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明专利涉及一种猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，该方法是利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成，快速检测猪血液或血清中的抗体。该测试纸条可广泛用于临床猪圆环病毒病的检测。与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为98.63％和95.83％。与ELISA相比，重组抗原免疫胶体金具有明显的优势：安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一，操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

公开(公告)号：CN101881770A

公开(公告)日：2010-11-10

申请号：CN200910014999.4

申请日：2009-05-08

申请人： 青岛农业大学 ,  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 ,  山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 周顺 ,  纪卫宁 ,  崔尚金 ,  李俊 ,  王金宝 ,  袁小远

IPC分类号： G01N33/569 ,  G01N33/558 ,  G01N33/532 ,  G01N33/552 ,  C12P19/34 ,  C12N15/70 ,  C12P21/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，该方法是利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成，快速检测猪血液或血清中的抗体。该测试纸条可广泛用于临床猪圆环病毒病的检测。与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为98.63％和95.83％。与ELISA相比，重组抗原免疫胶体金具有明显的优势：安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一，操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

公开(公告)号：CN101236205B

公开(公告)日：2013-06-19

申请号：CN200810014057.1

申请日：2008-01-23

申请人： 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

发明人： 王金宝 ,  张祯涛 ,  李俊 ,  任慧英 ,  吴家强 ,  张秀美 ,  丛晓燕 ,  温建新 ,  周顺

IPC分类号： G01N33/569

摘要： 本发明提供一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，该方法是针对PRRSV VR-2332株的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的氨基酸序列，建立针对欧洲型PRRSVN蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，重组质粒在大肠杆菌中成功表达，利用表达纯化的北美洲型N蛋白，制备用于PRRS抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒，该抗体试剂盒与IDEXX试剂盒的符合率均可达到90％，以纯化的欧洲型蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法，为PRRS抗体分型检测打下基础。