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公开(公告)号：CN105294837B
公开(公告)日：2020-04-03
申请号：CN201510658688.7
申请日：2015-10-12
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体WEHDEL，属于生物工程技术领域。本发明通过突变酵母内质网滞留信号肽FEHDEL，得到一系列滞留信号肽突变体。通过构建pESD‑Aga2‑FLAG‑ERS重组质粒(ERS,ER sequestration signal,内质网滞留信号肽)，分析Aga2‑FLAG‑ERS复合体在酵母体内的诱导和表面展示情况，并利用荧光标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白。根据细胞表面荧光的强弱，进而分析内质网滞留信号肽滞留效应的强弱。经流式细胞仪的分析，发现滞留信号肽突变体WEHDEL与原始的FEHDEL相比，滞留效应明显增强了。在最近建立的酵母内质网滞留系统中，利用内质网滞留信号肽的滞留效应来延长蛋白底物在内质网中的停留时间，以显著增大底物在内质网中的浓度，使蛋白酶即使在低浓度和低活性状态下也可以产生强的水解反应信号，从而便于检测和分析。
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公开(公告)号：CN110184292A
公开(公告)日：2019-08-30
申请号：CN201910523199.9
申请日：2019-06-17
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，属于抗体工程技术领域。本发明采用一种新型三启动子Fab表面展示载体来共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2和Infliximab的VH-CH1以及VL-CL两个结构域。其中VH-CH1和VL-CL两个结构域通过氨基端的内质网定位信号肽定位在内质网内组装成天然Fab形式片段，再通过Aga1-Aga2酵母细胞展示系统展示到细胞表面。本发明通过共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2，促进了Infliximab Fab片段的VH-CH1和VL-CL两个结构域在内质网内的折叠组装效率，明显提高了酵母细胞表面展示Infliximab Fab片段的抗原结合能力。
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公开(公告)号：CN108048480A
公开(公告)日：2018-05-18
申请号：CN201711193064.8
申请日：2017-11-24
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种基于酿酒酵母的split‑TEV‑Fast系统方法及其在检测蛋白互作中的应用，包括：1)构建载体pESD‑PPI，其含受半乳糖诱导的一个正向启动子和一个双向启动子，所述正向启动子用以表达TEV‑Fast蛋白酶底物与FLAG和HA标签序列，所述双向启动子用以表达拆分的TEV‑Fast蛋白酶和待测目的蛋白；2)用半乳糖同时诱导启动子，引发下游基因等量表达；3)利用分别识别FLAG和HA标签序列的荧光抗体对细胞进行标记；4)利用流式细胞仪检测细胞表面荧光信号，根据单双荧光信号判断蛋白之间相互作用的强度。本发明在TEV‑Fast蛋白酶及其底物‑COOH端使用不同强度的内质网滞留信号肽，可扩大检测蛋白互作的范围，并根据最终检测的单双荧光信号强度的比例分析蛋白互作的强弱。
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公开(公告)号：CN110184292B
公开(公告)日：2023-01-20
申请号：CN201910523199.9
申请日：2019-06-17
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，属于抗体工程技术领域。本发明采用一种新型三启动子Fab表面展示载体来共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2和Infliximab的VH‑CH1以及VL‑CL两个结构域。其中VH‑CH1和VL‑CL两个结构域通过氨基端的内质网定位信号肽定位在内质网内组装成天然Fab形式片段，再通过Aga1‑Aga2酵母细胞展示系统展示到细胞表面。本发明通过共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2，促进了Infliximab Fab片段的VH‑CH1和VL‑CL两个结构域在内质网内的折叠组装效率，明显提高了酵母细胞表面展示Infliximab Fab片段的抗原结合能力。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN110218737B
公开(公告)日：2022-12-23
申请号：CN201910523234.7
申请日：2019-06-17
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种利用酵母内质网滞留信号肽提高酵母细胞表面展示Fab片段抗原结合能力的重组载体，属于抗体工程技术领域。本发明利用GAL1‑GAL10双向启动子载体同时表达Adalimumab或Infliximab的VH‑CH1和VL‑CL两个结构域，通过氨基端内质网定位信号肽定位在内质网内组装成天然Fab形式片段，再利用Aga1‑Aga2酵母细胞展示系统展示到细胞表面。同时，通过将酿酒酵母内质网滞留信号肽融合到Fab片段VL‑CL结构域的羧基端，明显提高了酵母细胞表面展示的Fab片段结合抗原的能力，促进了功能性Fab片段的展示，从而更适用于Fab片段的酵母细胞表面展示，为抗体工程中Fab的改造方法提供了一种优化策略。
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公开(公告)号：CN105294837A
公开(公告)日：2016-02-03
申请号：CN201510658688.7
申请日：2015-10-12
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体WEHDEL，属于生物工程技术领域。本发明通过突变酵母内质网滞留信号肽FEHDEL，得到一系列滞留信号肽突变体。通过构建pESD-Aga2-FLAG-ERS重组质粒(ERS,ER sequestration signal,内质网滞留信号肽)，分析Aga2-FLAG-ERS复合体在酵母体内的诱导和表面展示情况，并利用荧光标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白。根据细胞表面荧光的强弱，进而分析内质网滞留信号肽滞留效应的强弱。经流式细胞仪的分析，发现滞留信号肽突变体WEHDEL与原始的FEHDEL相比，滞留效应明显增强了。在最近建立的酵母内质网滞留系统中，利用内质网滞留信号肽的滞留效应来延长蛋白底物在内质网中的停留时间，以显著增大底物在内质网中的浓度，使蛋白酶即使在低浓度和低活性状态下也可以产生强的水解反应信号，从而便于检测和分析。
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公开(公告)号：CN116555235A
公开(公告)日：2023-08-08
申请号：CN202310613615.0
申请日：2023-05-29
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明利用饱和突变和随机突变技术针对野生型HRV3C蛋白酶进行分子改造，使其从识别原有多肽序列LEVLFQ↓G变为识别多肽序列LEVLFQ↓M，得到了一系列HRV3C蛋白酶突变体。与wtHRV3C‑P相比，本发明提供的突变体针对底物LEVLFQ↓M有更好的特异性和切割活性，可以达到无痕切除蛋白融合标签的效果，从而拓宽了HRV3C蛋白酶的实际应用范围。
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公开(公告)号：CN108048480B
公开(公告)日：2021-04-23
申请号：CN201711193064.8
申请日：2017-11-24
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种基于酿酒酵母的split‑TEV‑Fast系统方法及其在检测蛋白互作中的应用，包括：1)构建载体pESD‑PPI，其含受半乳糖诱导的一个正向启动子和一个双向启动子，所述正向启动子用以表达TEV‑Fast蛋白酶底物与FLAG和HA标签序列，所述双向启动子用以表达拆分的TEV‑Fast蛋白酶和待测目的蛋白；2)用半乳糖同时诱导启动子，引发下游基因等量表达；3)利用分别识别FLAG和HA标签序列的荧光抗体对细胞进行标记；4)利用流式细胞仪检测细胞表面荧光信号，根据单双荧光信号判断蛋白之间相互作用的强度。本发明在TEV‑Fast蛋白酶及其底物‑COOH端使用不同强度的内质网滞留信号肽，可扩大检测蛋白互作的范围，并根据最终检测的单双荧光信号强度的比例分析蛋白互作的强弱。
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公开(公告)号：CN110218737A
公开(公告)日：2019-09-10
申请号：CN201910523234.7
申请日：2019-06-17
Applicant: 湖北大学
Abstract: 本发明公开了一种利用酵母内质网滞留信号肽提高酵母细胞表面展示Fab片段抗原结合能力的重组载体，属于抗体工程技术领域。本发明利用GAL1-GAL10双向启动子载体同时表达Adalimumab或Infliximab的VH-CH1和VL-CL两个结构域，通过氨基端内质网定位信号肽定位在内质网内组装成天然Fab形式片段，再利用Aga1-Aga2酵母细胞展示系统展示到细胞表面。同时，通过将酿酒酵母内质网滞留信号肽融合到Fab片段VL-CL结构域的羧基端，明显提高了酵母细胞表面展示的Fab片段结合抗原的能力，促进了功能性Fab片段的展示，从而更适用于Fab片段的酵母细胞表面展示，为抗体工程中Fab的改造方法提供了一种优化策略。
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