公开(公告)号：CN118064339A

公开(公告)日：2024-05-24

申请号：CN202410164567.6

申请日：2024-02-05

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  朱莺莺 ,  陈逸晗 ,  陈柔霖 ,  杜智慧

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/56 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12P19/12 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种无质粒合成3‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌的构建及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明通过强化表达GDP‑L‑fucose通路基因簇manB,manC,gmd和wcaG同时引入多拷贝的fut3Bc来实现3‑岩藻糖基乳糖的无质粒模式合成，同时，将大肠杆菌宿主基因组中manA位点上替换原始启动子为PJ23119，通过LC‑MS和离子色谱检测发现菌株B2P5F和B2P6F发酵所得的产物单一，除3‑岩藻糖基乳糖外无其他岩藻糖基化副产物形成；在5L发酵罐中，3‑岩藻糖基乳糖的产量在60h达到28.13g/L，产率为0.54g/L，具备工业化应用的潜力。

公开(公告)号：CN118028202A

公开(公告)日：2024-05-14

申请号：CN202410169332.6

申请日：2024-02-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  朱莺莺 ,  陶梦婷 ,  杨龙浩

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/54 ,  C12N15/61 ,  C12N15/56 ,  C12P19/26 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高效合成乳酰‑N‑二糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。公开了一种新的、更简单的微生物合成乳酰‑N‑二糖的策略，通过引入双歧杆菌LnbB基因，对产生LNT的大肠杆菌BL21(DE3)基因工程菌株进行改造，构建高产乳酰‑N‑二糖的工程菌株。乳酰‑N‑二糖产生的同时伴随着乳糖的再生，对乳酰‑N‑三糖II和乳酰‑N‑四糖合成相关的关键途径基因进行基因组整合，以提高乳酰‑N‑二糖的产量。最终的工程菌株通过摇瓶和补料分批培养分别产生3.54和26.88g/L的乳酰‑N‑二糖，具有良好的产业化前景。

公开(公告)号：CN113652385B

公开(公告)日：2023-10-03

申请号：CN202110900124.5

申请日：2021-08-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  朱莺莺 ,  李泽宇

IPC: C12N1/21 ,  C12N9/10 ,  C12N9/12 ,  C12N15/61 ,  C12N15/55 ,  C12N15/56 ,  C12N15/70 ,  C12P19/26 ,  C12P19/18 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产乳酰‑N‑四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以前期构建完成的高效生产前体物质乳酰‑N‑三糖II的菌株为出发菌株，过表达合成乳酰‑N‑四糖的关键基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因，并合理设计在载体pCDFDuet‑1上共表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因和强化UDP‑半乳糖途径关键基因UDP‑葡萄糖4差向异构酶基因(galE)，从而提高乳酰‑N‑四糖的合成，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。

公开(公告)号：CN116790539A

公开(公告)日：2023-09-22

申请号：CN202310677702.2

申请日：2023-06-08

Applicant: 江南大学

Inventor： 徐炜 ,  张文立 ,  张晓琦 ,  倪大伟 ,  沐万孟

IPC: C12N9/10 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/00 ,  C12P19/04 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种β‑(2,6)果聚糖蔗糖酶突变体的构建及应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明将微生物Pseudomonas orientalis来源的β‑(2,6)果聚糖蔗糖酶作为亲本，构建了单点突变体酶R91T。突变体R91T催化蔗糖的聚合能力明显提高，在1h内将20％的蔗糖和20％的乳糖转化为低聚乳果糖的转化率可达40％，同时该突变体将30％蔗糖转化为高分子量果聚糖的转化率达49％。这一发现对于工业化制备低聚乳果糖，以及β‑(2,6)果聚糖蔗糖酶的工业化应用有重要的研究价值。

公开(公告)号：CN116355819A

公开(公告)日：2023-06-30

申请号：CN202310187376.7

申请日：2023-03-01

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  朱莺莺 ,  李泽宇 ,  张文立

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/53 ,  C12N15/61 ,  C12N15/56 ,  C12N15/55 ,  C12N15/54 ,  C12P19/26 ,  C12N15/70 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了高效合成乳酰‑N‑四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。通过CRISPR相关的转座酶系统(CRISPR‑associated transposases,MUCICAT))对大肠杆菌基因组进行多位点的基因编辑，实现大肠杆菌基因组不同拷贝数编码β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶的基因整合，再引入β‑1,3‑半乳糖基转移酶，从而构建了多株生产乳酰‑N‑四糖的工程大肠杆菌，在摇瓶实验过程中，乳酰‑N‑四糖的摇瓶产量可以达到6.07g/L，为进一步工业化生产与合成其他复杂母乳寡糖奠定了基础。

公开(公告)号：CN113201512B

公开(公告)日：2022-03-15

申请号：CN202110613892.2

申请日：2021-06-02

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  倪大伟 ,  徐炜

IPC: C12N9/10 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/18 ,  C12P19/00

Abstract: 本发明公开了一种产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Lactobacillus reuteri 121的部分序列截断的菊糖蔗糖酶作为亲本，构建了单点突变体酶R425W。R425W显著改变了产物链长，使菊糖蔗糖酶失去合成多糖的能力，大量积累低聚果糖，尤其是蔗果三糖。经反应条件优化，R425W生产蔗果三糖的产量最高可达206g/L。生产条件为pH 6.5的磷酸盐缓冲液，45℃，700g/L的蔗糖，15μg/mL的加酶量，反应时间为36h。这一发现对于工业化制备蔗果三糖，以及菊糖蔗糖酶的工业化应用有重要的研究价值。

公开(公告)号：CN113308456B

公开(公告)日：2022-03-04

申请号：CN202110496246.2

申请日：2021-05-07

Applicant: 江南大学

Inventor： 张文立 ,  沐万孟 ,  陈佳俊 ,  陈丁 ,  徐炜 ,  陈秋铭

IPC: C12N9/90 ,  C12N15/61 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/02 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种热稳定性增强的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了以来源于微生物Thermoclostridium caenicola的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为亲本，将107位的甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro，155位的苯丙氨酸Phe突变为酪氨酸Tyr，162位的天冬氨酸Asp突变为苏氨酸Thr，70位的丙氨酸Ala突变为脯氨酸Pro，获得单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P，热力学和动力学稳定性得到了提高，在工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的应用价值。

公开(公告)号：CN113917065A

公开(公告)日：2022-01-11

申请号：CN202111159401.8

申请日：2021-09-30

Applicant: 江南大学

Inventor： 熊磊 ,  沐万孟 ,  陈尚卫 ,  朱松 ,  罗国聪 ,  顾小红 ,  范大明 ,  赵建新

IPC: G01N30/96

Abstract: 本发明公开了一种利用离子色谱同时测定乳糖‑N‑丙糖II和乳糖‑N‑新四糖的检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先用超纯水溶解乳糖‑N‑四糖(LNnt)和乳糖四糖II(LNT II)标准品，配置成不同浓度的标准溶液，进行阴离子交换色谱‑脉冲安培法进行检测获得标准曲线，再对待测样品中LNT II和LNnT的浓度。本发明中LNT II的仪器检出限为1.4mg/L、定量限为15.1mg/L，LNnT仪器检出限为2.8mg/L、定量限为16.4mg/L。本发明对LNT II和LNnT的回收率均在95％‑103％之间，具有良好的重现性，能够用于准确检验合成过程是否完成。

公开(公告)号：CN113512544A

公开(公告)日：2021-10-19

申请号：CN202110797099.2

申请日：2021-07-14

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  武彦昌 ,  陈秋铭 ,  张文立

IPC: C12N9/90 ,  C12N15/61 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/02 ,  C12P19/24 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了来源于微生物Deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶作为亲本，利用基因突变技术，第37位的精氨酸替换成赖氨酸和第164位的甘氨酸替换成亮氨酸，得到双突变体R37K/G164L。在温度为60℃时，测得野生酶的半衰期为46.27min,突变体酶R37K/G164L的半衰期为185.83min，两点突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高。这一发现对于研究更多热稳定性甘露糖异构酶具有重要的研究价值。

公开(公告)号：CN113215125A

公开(公告)日：2021-08-06

申请号：CN202110615300.0

申请日：2021-06-02

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  倪大伟 ,  徐炜 ,  张书琦

IPC: C12N9/10 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/18 ,  C12P19/04 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶的截断酶作为亲本，构建了四点突变体酶A310E/S346A/I478M/A491S(简称M4)，并进一步截断N‑端33个氨基酸的突变体M4N‑33。M4N‑33在55℃的半衰期由原来的不足5min提高到大约10h，熔融温度由原来的55.00℃提高到61.27℃，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃，在最适催化条件下的酶活提高了52％。这一发现对于工业化制备微生物菊糖及转糖苷酶的工业化应用有重要的研究价值。