公开(公告)号：CN117778377B

公开(公告)日：2024-07-23

申请号：CN202311725165.0

申请日：2023-12-14

Applicant: 湖北大学

Inventor： 马立新 ,  陈晚苹 ,  崔佳凯 ,  陈苗苗 ,  王飞 ,  王珑瑜 ,  谢晓晨

IPC: C12N15/10 ,  C12N15/70 ,  C12N15/66

Abstract: 本发明公开了基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法，具体为：构建抗性基因重构载体并利用Argonaute对其进行线性化处理，将目标DNA分成多个小片段DNA并合成，再将小片段DNA装载到抗性基因重构载体中，利用SLIC克隆和抗性基因重构实现目标DNA的组装。本发明方法综合了SLIC克隆和抗性基因重构策略，重构一次抗性基因可以组装5‑6个小片段，效率更高效，周期短，而且可以根据DNA的片段长度，灵活选择重构抗性基因的次数，本发明也不会引入由PCR带来的突变，重构后的大片段无需进行二次测序，节省时间和成本。本发明为大片段DNA的合成与组装技术提供了新的思路。

公开(公告)号：CN114703328B

公开(公告)日：2023-12-19

申请号：CN202210440583.4

申请日：2022-04-25

Applicant: 湖北大学

Inventor： 董衍明 ,  马立新 ,  王媛 ,  罗婷 ,  邱李炀

IPC: C12Q1/70 ,  C12N15/113 ,  C12Q1/6806 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明属于B19病毒检测技术领域，公开了一种PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括三条或单条引导PfAgo靶向B19病毒ns1基因的gDNA，其序列SEQ ID NO:1～3所示；gDNA引导PfAgo特异性切割B19病毒ns1基因片段，进而生成靶向荧光分子信标的gn‑DNA进行第二轮切割，实现对B19病毒特异性和灵敏性检测。相对于现有的B19病毒检测方法，本发明不仅检测成本低，灵敏度高且特异性强，具有重要的实际应用价值。

公开(公告)号：CN116656648A

公开(公告)日：2023-08-29

申请号：CN202310562239.7

申请日：2023-05-16

Applicant: 湖北大学

Inventor： 马立新 ,  王珑瑜 ,  王飞 ,  谢晓晨 ,  陈晚苹 ,  黄福勇

IPC: C12N9/22 ,  C12N15/55 ,  C12N15/113 ,  C12N15/10 ,  C12Q1/6813

Abstract: 本发明公开了具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白及其应用，所述PfAgo突变体蛋白相对于SEQ ID NO.1所示序列，具有第617位和/或618位的氨基酸突变，具体为：K617E/G和/或L618Y/F/W/G。相对于野生型PfAgo蛋白，本发明提供的PfAgo突变体蛋白在30～95℃的温度范围均有活性，有效扩展了pAgo蛋白的使用范围。

公开(公告)号：CN115975985A

公开(公告)日：2023-04-18

申请号：CN202211260452.4

申请日：2022-10-14

Applicant: 湖北大学

Inventor： 马立新 ,  王飞 ,  王珑瑜 ,  谢晓晨 ,  陈晚苹

IPC: C12N9/22 ,  C12N15/55 ,  C12P19/34 ,  C12Q1/6844

Abstract: 本发明公开了一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用，所述Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该Argonaute蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了上述Argonaute蛋白的体外合成方法，并发现该蛋白对两种向导5’OH‑gRNA和5’P‑gRNA具有结合活性，其能够利用这两种向导去切割靶ssDNA和利用5’OH‑gRNA去切割靶RNA，实现靶向DNA或靶向RNA编辑，同时还可切割质粒。因此，本发明为基于原核生物来源的Argonaute蛋白的基因克隆和分子检测提供了一种新的工具。

公开(公告)号：CN112322784B

公开(公告)日：2023-01-24

申请号：CN202011194966.5

申请日：2020-10-30

Applicant: 湖北大学

Inventor： 马立新 ,  王珑瑜 ,  何如怡 ,  吕彬 ,  王飞 ,  王亚平

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6858 ,  C12N15/11 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用。该寡聚核苷酸组包括包括四种寡核苷酸分子，分别标记为A、B、A’和B’，能够与目的基因的核酸分子进行互补配对。该试剂盒包括该寡聚核苷酸组、分子信标、PfAgo酶和DNA连接酶。本发明利用了PfAgo酶编辑DNA，LCR反应良好的特异性和区分单碱基特异性的能力以及分子信标的高灵敏度的特点，对检测的靶目标放大，其检测灵敏度可以达到1aM，并且具有好的特异性，还能实现病毒各种亚型的多通道分析，操作也简单准确。

公开(公告)号：CN113913412A

公开(公告)日：2022-01-11

申请号：CN202111193669.3

申请日：2021-10-13

Applicant: 湖北大学

Inventor： 翟超 ,  马立新 ,  高榕 ,  赵晶

IPC: C12N9/58 ,  C12N15/57 ,  C12N15/81 ,  C12N1/19 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明公开了蛋白酶K突变体及其制备方法，属于蛋白质工程技术领域，其中所述突变体为：将如SEQ ID NO.1所示的野生型蛋白酶K的第44位氨基酸突变，具体为将第44位的丙氨酸突变为丝氨酸。本发明以蛋白酶K的晶体结构为基础，通过蛋白质工程和定点突变等技术对蛋白酶K进行改造，首次获得了如SEQ ID NO.3所示的突变体A44S。研究发现该突变体A44S的比酶活较野生型提高约21％，从而降低了蛋白酶K的应用成本，提高了该酶在洗涤、饲料和食品等多种行业的工业应用价值，同时为该酶的催化机理研究提供了重要线索。

公开(公告)号：CN110358768B

公开(公告)日：2021-09-14

申请号：CN201910692143.6

申请日：2019-07-30

Applicant: 湖北大学

Inventor： 杨世辉 ,  彭文舫 ,  郑艳丽 ,  易犁 ,  马立新

IPC: C12N15/113 ,  C12N15/90 ,  C12N1/21 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR‑Cas系统的基因组编辑方法及其应用。本发明的目的在于以Z.mobilis 4为模式菌株，利用其自身基因组编码的I‑F型CRISPR‑Cas系统搭建一套基因组编辑平台。为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。其技术方案要点包括：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；针对目标位点选取guideRNA序列；将guideRNA引物序列构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上；将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。

公开(公告)号：CN113373129A

公开(公告)日：2021-09-10

申请号：CN202110581929.8

申请日：2021-05-25

Applicant: 湖北大学

Inventor： 马立新 ,  李文强 ,  王飞 ,  何如怡 ,  刘洋

IPC: C12N9/22 ,  C12N15/55 ,  C12N15/113

Abstract: 本发明公开了一种原核生物来源的Mbp_Argonaute蛋白及其应用，所述Mbp_Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或如与SEQ ID NO：1具有至少50％或至少80％同源性的序列所示。本发明合成了一种来源于耐冷原核生物Mucilaginibacter paludis的Argonaute蛋白基因，将该蛋白命名为MbpAgo，研究发现该MbpAgo对单链向导DNA具有结合活性，并且对与单链向导DNA互补配对的靶RNA和/或靶DNA具有核酸酶活性，因此可利用所述MbpAgo进行体内外靶向RNA编辑，进而对遗传材料进行特异性位点修饰。所述MbpAgo不仅可对高级结构的RNA进行修饰，而且不会影响动植物细胞的内源RNAi途径，为RNA编辑提供了一个全新的有力工具，并且切割活性强，特异性好。

公开(公告)号：CN110684692B

公开(公告)日：2021-08-17

申请号：CN201911016217.0

申请日：2019-10-24

Applicant: 湖北大学

Inventor： 翟超 ,  马立新 ,  颜光波 ,  何文聪 ,  吴刚 ,  李允静 ,  彭方

IPC: C12N1/20 ,  C12N9/52 ,  C12N9/10 ,  C12P21/06 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明提供了一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780，其保藏编号为CCTCC NO：M2019784；本发明还提供了该株嗜麦芽糖窄食单胞菌780的应用；利用该菌株生产的低温蛋白酶可用于环境污染物5‑烯醇式丙酮酸莽草酸‑3‑磷酸合成酶的降解，表明该菌株具有改善土壤、保护环境等方面的潜力。该嗜麦芽糖窄食单胞菌780所产生的蛋白酶的最适温度为65℃，其在18℃时能达到最适温度下活力的40％，4℃时蛋白酶能保持在最适温度下活力的20％左右。由于环境中污染物CP4‑EPSPS的存在条件较广，嗜麦芽糖窄食单胞菌780所诱导生产的低温蛋白酶适用于不同环境条件下降解EPSPS，在环境治理中具有很好的应用前景。

公开(公告)号：CN110331157B

公开(公告)日：2021-06-08

申请号：CN201910712666.2

申请日：2019-08-02

Applicant: 湖北大学

Inventor： 彭文舫 ,  胡晓韵 ,  易犁 ,  范贤 ,  马立新

IPC: C12N15/70 ,  C12N9/50 ,  C12Q1/37

Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法、AEP环化酶环化能力鉴定方法及其应用。本发明通过在大肠杆菌中利用不同的融合标签进行融合表达，之后通过移除融合标签得到表达量较高的AEP环化酶，其表达量为0.36±0.05mg/mL，高于原先文献报道的1.8mg/L。本发明采用一种新的方式验证AEP环化酶的环化能力，通过构建一种串联底物，选取能够较好的在SDS‑PAGE中观察到并且具备环化的可能性的蛋白为底物，并构建包含TEV蛋白酶的底物序列的串联底物，根据蛋白酶切割后底物大小的变化或者条带数量来鉴定是否环化，操作简单、方便，实用性强。