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公开(公告)号：CN117286111B
公开(公告)日：2024-06-18
申请号：CN202310239489.7
申请日：2023-03-13
IPC分类号： C12N7/00 , C12N15/50 , C12N15/64 , C12N15/65 , C12N15/85 , C12N7/01 , C12N5/10 , A61K39/215 , A61P31/14 , C12R1/93
摘要： 本发明公开了牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒N蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用。本发明从腹泻犊牛的粪便中分离获得牛冠状病毒内蒙古分离株，该毒株能较好适应细胞传代，在此基础上，采用高效酵母系统构建牛冠状病毒内蒙古分离株的感染性cDNA克隆；本发明还构建了稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK‑21细胞系。本发明应用所构建的感染性cDNA克隆和BHK‑21细胞系建立了牛冠状病毒内蒙古分离株的反向遗传操作系统，采用该反向遗传系统拯救得到表达外源蛋白的重组牛冠状病毒，为病毒活载体疫苗的研究提供技术平台；还可以拯救得到牛冠状病毒报告病毒，为牛冠状病毒体内、体外复制动态研究提供可视化技术平台。
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公开(公告)号：CN117286111A
公开(公告)日：2023-12-26
申请号：CN202310239489.7
申请日：2023-03-13
IPC分类号： C12N7/00 , C12N15/50 , C12N15/64 , C12N15/65 , C12N15/85 , C12N7/01 , C12N5/10 , A61K39/215 , A61P31/14 , C12R1/93
摘要： 本发明公开了牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒N蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用。本发明从腹泻犊牛的粪便中分离获得牛冠状病毒内蒙古分离株，该毒株能较好适应细胞传代，在此基础上，采用高效酵母系统构建牛冠状病毒内蒙古分离株的感染性cDNA克隆；本发明还构建了稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK‑21细胞系。本发明应用所构建的感染性cDNA克隆和BHK‑21细胞系建立了牛冠状病毒内蒙古分离株的反向遗传操作系统，采用该反向遗传系统拯救得到表达外源蛋白的重组牛冠状病毒，为病毒活载体疫苗的研究提供技术平台；还可以拯救得到牛冠状病毒报告病毒，为牛冠状病毒体内、体外复制动态研究提供可视化技术平台。
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公开(公告)号：CN114395583B
公开(公告)日：2024-03-29
申请号：CN202111284075.3
申请日：2021-11-01
申请人： 扬州大学
摘要： 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。
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公开(公告)号：CN113736799B
公开(公告)日：2024-02-06
申请号：CN202111092942.3
申请日：2021-09-17
摘要： 本发明提供山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用，属于生物技术领域。该构建方法包括：以山羊副流感病毒3型的总RNA反转录产物为模板，扩增A、B、C和D片段；将片段A和B、片段C和D分别插入pCI‑neo‑1载体中，得到重组载体pCI‑A‑B、pCI‑C‑D；以pCI‑A‑B为模板，扩增片段A‑B；以pCI‑C‑D为模板，扩增C‑D片段；将线性化pYES1L载体、A‑B和C‑D片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆质粒。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染细胞后能够快速产生细胞病变，病毒滴度高，且保持稳定。
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公开(公告)号：CN118652354A
公开(公告)日：2024-09-17
申请号：CN202410964977.9
申请日：2024-07-18
申请人： 扬州大学
IPC分类号： C07K19/00 , C12N9/02 , C12N15/85 , C12N15/62 , G01N33/569 , G01N33/58 , G01N33/535 , G01N33/533 , G01N33/543
摘要： 本发明公开了一种猪盖他病毒的融合抗原、试剂盒及其制备方法和应用，所述盖他病毒的融合抗原，主要采用将高斯萤光素酶基因与密码子优化的GETV E2抗原基因进行重组获得表达载体，随后，将含有GLuc‑E2的表达载体转染到哺乳动物细胞系中，GLuc‑E2蛋白会以分泌形式表达于细胞上清中。无需进行蛋白纯化步骤，直接收取细胞上清即可用于疾病的检测。本发明特异性强，与非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪日本脑炎病毒不发生交叉反应。
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公开(公告)号：CN116063563A
公开(公告)日：2023-05-05
申请号：CN202211203262.9
申请日：2022-09-29
申请人： 扬州大学
IPC分类号： C07K19/00 , C12N9/02 , C12N15/867 , G01N33/569 , G01N33/535 , G01N33/68
摘要： 本发明提供一种融合抗原GLuc‑p30及其制备方法、试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括：包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板、荧光素酶、融合抗原，非洲猪瘟抗体阳性血清，非洲猪瘟抗体阴性血清，荧光素酶底物、洗涤液，本发明通过慢病毒转导建立的稳定细胞株表达GLuc‑p30融合抗原，无需纯化，简化了抗原的准备过程，可以有效地检测样品中非洲猪瘟抗体，与符合国家标准非洲猪瘟抗体检测试剂盒的符合率达99％以上且有更好的检测灵敏性和特异性，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
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公开(公告)号：CN114395583A
公开(公告)日：2022-04-26
申请号：CN202111284075.3
申请日：2021-11-01
申请人： 扬州大学
摘要： 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。
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公开(公告)号：CN114395579B
公开(公告)日：2024-04-19
申请号：CN202111276598.3
申请日：2021-10-29
申请人： 扬州大学
摘要： 本发明公开了一种基因I型与基因III型日本脑炎病毒感染性克隆及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过设计四对保守引物，分四段一次扩增出涵盖基因I型与基因III型JEV基因组全长的片段，基于DNA片段末端的同源性，利用酵母菌中的转化偶联重组技术，将分段的病毒基因组片段与线性化载体进行同源重组，一次性分别构建出携带基因I型与基因III型JEV基因组全长的重组质粒。重组质粒线性化处理后，利用T7启动子经体外转录出病毒RNA，RNA转染BHK‑21细胞后即可获得感染性克隆病毒。本发明可在酵母菌中稳定传代10代以上，不存在基因组本身序列的突变、缺失或外源序列的插入。
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公开(公告)号：CN115786280A
公开(公告)日：2023-03-14
申请号：CN202210997589.1
申请日：2022-08-19
申请人： 扬州大学
摘要： 本发明公开了一株稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将一段C38‑mCherry‑T2A基因序列SEQ ID NO.1插入到GI型日本脑炎病毒基因组的5′UTR与C基因之间，构建获得含有T7启动子的重组病毒感染性克隆。利用体外转录技术获得重组病毒的基因组RNA全长，并转染至BHK‑21细胞中，当细胞出现典型的病变时，收取细胞上清即可获得表达mCherry蛋白的重组病毒。该重组病毒能够稳定高效地表达mCherry蛋白，插入的mCherry基因在病毒连续传代过程中具有遗传稳定性，且不影响病毒蛋白的翻译、加工以及病毒的复制能力。本发明所述的稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒在抗病毒药物筛选方面具有广泛的应用价值。
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公开(公告)号：CN114395579A
公开(公告)日：2022-04-26
申请号：CN202111276598.3
申请日：2021-10-29
申请人： 扬州大学
摘要： 本发明公开了一种基因I型与基因III型日本脑炎病毒感染性克隆及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过设计四对保守引物，分四段一次扩增出涵盖基因I型与基因III型JEV基因组全长的片段，基于DNA片段末端的同源性，利用酵母菌中的转化偶联重组技术，将分段的病毒基因组片段与线性化载体进行同源重组，一次性分别构建出携带基因I型与基因III型JEV基因组全长的重组质粒。重组质粒线性化处理后，利用T7启动子经体外转录出病毒RNA，RNA转染BHK‑21细胞后即可获得感染性克隆病毒。本发明可在酵母菌中稳定传代10代以上，不存在基因组本身序列的突变、缺失或外源序列的插入。
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