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公开(公告)号：CN118581153A
公开(公告)日：2024-09-03
申请号：CN202411060118.3
申请日：2024-08-05
摘要： 本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及DNA聚合酶介导的核苷酸序列编辑方法及组合物。本发明发现，细胞内源性DNA聚合酶能够介导核酸酶对靶核苷酸的编辑。这样能够在保证碱基效果的同时，避免来自于病毒或者细菌的细胞外源逆转录酶或者聚合酶所存在的免疫原应、低保真性等安全性问题。同时，也能够减少或避免外源性DNA聚合酶的使用，从而降低了递送难度。因而，本发明创建一种新型的更安全更容易递送的基因编辑工具及方法，为实现基因编辑技术在动物遗传性状改良、基因编辑育种与遗传疾病治疗等多个领域的开发应用提供了进一步的技术支持。
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公开(公告)号：CN117866924A
公开(公告)日：2024-04-12
申请号：CN202311581379.5
申请日：2023-11-24
申请人： 华中农业大学
IPC分类号： C12N9/22 , C12N9/12 , C12N15/55 , C12N15/54 , C12N15/113
摘要： 本发明公开了多sgRNA介导的EXPERTplus先导基因编辑系统及其应用。本发明为了提升EXPERT系统的编辑效率，在EXPERT系统的基础上，在ori‑sgRNA与expegRNA间增设了多条sgRNA。结果显示，EXPERTplus系统可以进一步提高编辑效率。相比于PE系统，EXPERTplus系统可编辑的范围更广，可以实现88bp的精确替换，且编辑效率更高。此外，由于开发的EXPERTplus系统仅仅只在一条链上产生切口，没有产生DNA双链断裂，相比于PE3与twin PE系统均可能会产生DNA双链断裂，其将产生更低的indels，因此更为安全。
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公开(公告)号：CN116536352A
公开(公告)日：2023-08-04
申请号：CN202210093455.7
申请日：2022-01-26
申请人： 华中农业大学
摘要： 本发明公开了一种复制型引导编辑器介导的高效精准多基因编辑系统。本发明提供了一种用于多基因编辑的载体，其能够表达由Cas9切刻酶或其变体和反转录酶或其变体融合而成的融合蛋白、EBNA1蛋白和Csy4蛋白；并且含有Orip元件和用于插入pegRNA编码序列的区域；所述用于插入pegRNA编码序列的区域含有插入位点和位于所述插入位点上游的启动子。相比于传统方法，该技术可一次性精确高效编辑多个基因，在基因治疗、多基因动物疾病模型的构建、基因设计育种以及聚合精准育种等领域具有广泛的应用前景。
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公开(公告)号：CN110305899A
公开(公告)日：2019-10-08
申请号：CN201910559340.0
申请日：2019-06-25
申请人： 华中农业大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/90 , C12N15/113
摘要： 本发明公开了一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，所述打靶载体是以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上。将该打靶载体与含特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA的CRISPR/Cas9切割载体共转染猪真核细胞中，可以将外源基因定点整合至GAPDH基因下游。本发明提供的这一打靶位点，可以拓宽外源基因在猪基因组中整合位点的范围，为制备外源基因在猪基因组中高效稳定的表达奠定基础。
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公开(公告)号：CN116904477A
公开(公告)日：2023-10-20
申请号：CN202311069870.X
申请日：2023-08-23
申请人： 华中农业大学
IPC分类号： C12N15/12 , C07K14/47 , C12N15/113 , C12N9/22 , C12N5/10 , C12N15/85 , C12N15/867 , A01K67/027 , A61K48/00 , A61P31/14
摘要： 本发明公开了利用单碱基编辑饱和点突变文库筛选并鉴定的CALR基因突变体及其在猪抗乙型脑炎病毒中的应用，利用piggyBac转座系统构建了ancBE4max核酸酶稳定表达的猪源PK‑15细胞，并制备了覆盖CALR基因全部外显子和内含子的碱基突变细胞库，通过接种JEV诱导细胞死亡进行表型筛选，鉴定到CALR基因第764‑767位碱基由GGGG连续突变为AAAA能抑制JEV复制但是不影响CALR基因自身蛋白表达，该突变位点可作为抑制JEV感染的有效抗病靶点，在猪的抗病育种和药物治疗方面具有较大的推广应用价值。
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公开(公告)号：CN115704016A
公开(公告)日：2023-02-17
申请号：CN202110927367.8
申请日：2021-08-10
申请人： 华中农业大学
摘要： 本发明公开了一种利用dCas9‑p450系统进行定点突变的方法。本发明具体地公开了一种将细胞色素p450氧化酶(CYP)家族的关键酶CYP3A4蛋白与dCas9(dead Cas9)蛋白融合形成的融合蛋白及dCas9‑P450系统，所述dCas9‑P450系统包括重组载体dCas9‑p450、sgRNA表达载体、黄曲霉毒素B1(AFB1)，并公开了利用该系统将p450酶在特定基因组区域高表达，从而使得该区域的AFB1代谢成为AFBO，AFBO与靶位点DNA形成络合物，在靶位点定点引入随机突变的方法。利用该方法可以突变特定核苷酸序列，为基因功能研究提供可行的方法和强大、灵活的基因编辑工具。
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公开(公告)号：CN112280802A
公开(公告)日：2021-01-29
申请号：CN202011227220.X
申请日：2020-11-05
申请人： 华中农业大学
摘要： 本发明公开了一种稳定表达BE4蛋白的猪肾上皮细胞系的制备方法，以传代良好的猪肾上皮细胞（PK‑15）为宿主细胞，共转染含BE4融合蛋白序列的piggyBac转座子（PB‑BE4max）载体和转座酶表达载体质粒，经过嘌呤霉素筛选阳性细胞群，然后挑选单克隆细胞系，并通过扩增BE4的特征片段以及转染活性sgRNA验证编辑活性，从而得到的稳定表达BE4蛋白的转化体。利用上述方法制备的猪肾上皮细胞系能稳定表达BE4蛋白，在猪基因组功能研究、转基因猪制备、抗药靶点筛选等猪基因工程领域具有重要的应用价值。
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公开(公告)号：CN110358792A
公开(公告)日：2019-10-22
申请号：CN201910658641.9
申请日：2019-07-19
申请人： 华中农业大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/113 , C12N15/90 , C12N5/10
摘要： 本发明公开了一种将外源基因定点整合至ACTB（beta-actin）基因下游的打靶载体，所述的打靶载体是以ACTB基因终止密码子上下游的部分序列为左、右同源臂，将左同源臂、2A剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来并构建到真核表达载体或克隆载体骨架上。将该打靶载体与含特异性靶向猪ACTB基因下游的CRISPR/Cas9切割载体共转染至猪真核细胞中，实验及测序检测证实该外源基因定点整合至ACTB基因下游。本发明提供的这一打靶位点，可以拓宽外源基因在猪基因组中整合位点的范围，为制备外源基因高效稳定表达的转基因猪奠定基础。
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公开(公告)号：CN118460613A
公开(公告)日：2024-08-09
申请号：CN202410672757.9
申请日：2024-05-28
申请人： 华中农业大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N5/10 , C12N9/22 , C12N15/113 , C12N15/12 , A01K67/0275
摘要： 本申请涉及多基因敲除技术领域，具体涉及一种多基因精准、高效编辑系统开发与应用。该基因敲除质粒利用epi元件、U6启动子或Csy4元件结合gRNA，构建gRNA表达盒，以延长该基因敲除质粒于目的细胞中的表达时间来提供对目的细胞的多基因敲除效率。本申请为哺乳动物多基因敲除提供了一种全新的技术手段，为提高基因敲除效率，构建基因敲除细胞系和基因敲除工程动物等提供了新技术和新工具。
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公开(公告)号：CN116536353A
公开(公告)日：2023-08-04
申请号：CN202210094701.0
申请日：2022-01-26
申请人： 华中农业大学
IPC分类号： C12N15/85 , C12N15/65 , C12N15/62 , C12N15/38 , C07K19/00 , C12N9/22 , C12N9/12 , C12N15/113 , C12N5/10
摘要： 本发明公开了一种复制型高效引导编辑编辑系统。本发明提供了一种用于基因编辑的载体，其能够表达由Cas9切刻酶或其变体和反转录酶或其变体融合而成的融合蛋白和EBNA1蛋白或其突变体EBNA1Mut；并且含有Orip元件和用于插入pegRNA编码基因的区域；所述用于插入pegRNA编码基因的区域含有插入位点和位于所述插入位点上游的启动子。本发明构建的附加体引导编辑系统载体通过延长编辑时间提高了编辑效率，且避免了外源基因整合导致的插入突变。相比于已有其他系统，其综合了其他系统很难同时兼备的高效，安全，精准特点，为利用引导编辑系统在基因组精准编辑、疾病模型构建和基因治疗等领域的应用奠定基础。
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